2018 Fiscal Year Research-status Report

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）シートを用いた難治性偽関節の低侵襲治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	17K10981
Research Institution	Nara Medical University
Principal Investigator	面川庄平奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (70597103)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	田中康仁奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30316070) 赤羽学奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (40326327) 河村健二奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (20445076) 清水隆昌奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (70464667)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	細胞シート / 細胞外マトリックスシート / 液体窒素 / 偽関節 / 成長因子
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、細胞外マトリックス(ECM)シートを用いて、難治性偽関節の治療が可能か否かを実験的に検証することである。ECMシートの作製は、間葉系幹細胞由来の骨形成細胞（OSC)シートを液体窒素処理により殺細胞化して作製した。第一段階の検証としてECMシートの細胞の生存率は0.2%であること、 ECMシートにはⅠ型コラーゲンが破壊されずに含有されること、ECMシートに骨誘導能はあるが骨形成能は少ないことが予想された。第二段階として以下を検証した。OCSシートとECMシートにm-PERとプロテアーゼ阻害剤を用いて細胞融解とタンパク質抽出を行なった。ELISA法によりBMP-2, VEGF, bFGFを定量した(n=6/群)。さらに、12週齢Fischer 344 ラット18 匹を使用し偽関節モデルを作成、9匹にECMS2枚を偽関節部に全周性に巻くように移植した。シート移植しない偽関節群とECMS移植群の2群で単純X線、組織像、力学試験により比較した。結果は以下のとおりである。1)BMP-2は99%( 1シートあたりの平均含有量OCS: 31.2pg, ECM: 30.8pg)、bFGFは75% (OCS: 288pg, ECM: 217pg) VEGFは67%(OCS: 2797pg, ECM: 1869pg)残存した。2)8週での骨癒合率は、OSCシート移植群で100%、ECMシート移植群で14%であった。偽関節群の組織所見は、骨折部の瘢痕形成と骨皮質の萎縮であった。ECMシート移植群は5週でシート内の旺盛な石灰化が観察され、8週で骨性架橋を認めた。力学試験では、平均最大強度が偽関節群:10.3±9.6 N 、ECMシート移植群：45.2±24 Nであった(p=0.008)。平均最大強度はECMS移植群が偽関節群と比較して有意に高値を示した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ECMシートに含有される成長因子を評価することで、骨形成に関わるたんぱく質、成長因子が維持されることが判明した。この結果は移植実験におけるECMシートの骨形成能保持の根拠となる。今回は同系移植のみでの評価となるが、免疫拒絶が全くない環境では著明な骨形成を確認できた。この結果はECMシートが骨誘導能と骨伝導能を併せ持つマテリアルであること示唆し、今後同種移植や異種移植を行う実験においても偽関節部の骨形成を想定できる。
Strategy for Future Research Activity	ECMシートに骨誘導能と骨伝導能が存在することが判明したが、その抗原性を評価していない。シート内に存在すると考える死細胞にはHLAが残存しており、それが今後同種移植や異種移植において免疫拒絶反応を起こす可能性がある。同種移植においてその骨形成能を評価すること、さらには免疫反応を評価することが今後の課題である。
Causes of Carryover	研究計画の進捗によって研究備品購入に変更が生じたため、最終年で購入し研究を完遂させる予定である。