2018 Fiscal Year Research-status Report
滑膜肉腫における変異SWI/SNFクロマチン制御複合体の機能解析
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17K10985
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
中山 タラントロバート 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (00365298)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 希少がん / 肉腫 / AYA世代 / SWI/SNF / BAF / クロマチンリモデリング複合体 / SS18-SSX / 遺伝子発現制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
滑膜肉腫は、腫瘍特異的染色体転座t(X;18)(p11;q11)、およびそれに伴う融合遺伝子SS18-SSXの発現をほぼ全例で認め、発がんに大きく関与していることが示唆されている。疾患特異的融合遺伝子のカウンターパートであるSS18、SSXの機能が解明されずにいたが、近年の詳細な分子生物学的研究の成果から、SS18はATP依存性クロマチン制御複合体で、細胞内の遺伝子発現調節に極めて重要な役割を担うSWI/SNF（BAF）複合体のサブユニットであることが明らかとなった。今回の研究では、SS18-SSXを有する変異SWI/SNF（BAF）複合体の機能異常が滑膜肉腫のがん化に深く関与しているという仮説のもと、滑膜肉腫における変異SWI/SNF（BAF）複合体の分子生物学的機能を解析している。
本研究には、SS18-SSXを発現している滑膜肉腫の細胞株を用いている。核内タンパク質の抽出、SWI/SNF複合体のサブユニットに対する抗体を用いた免疫沈降法、およびウエスタンブロット法により、疾患特異的融合遺伝子SS18-SSXはSWI/SNF複合体に結合することを確認した。同時に、SWI/SNF(BAF)複合体の主要なサブユニットで、腫瘍抑制遺伝子として知られるSMARCB1（BAF47)のタンパク質発現の低下、SWI/SNF（BAF）複合体への結合能の低下を確認した。
SS18-SSXをノックダウン（KD）するためのコンストラクト（shRNA）をいくつか作成した上で、それぞれのKD効率を解析し、最も効率のいいSS18-SSX KDの実験系を確立した。さらに、SS18-SSXをKDした細胞と、野生型の細胞との生化学的プロファイルの比較を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究に必要な滑膜肉腫の細胞株を収集したが、本研究における生化学的な解析結果が、ある細胞株に特異的な現象ではなく、滑膜肉腫という疾患に特異的なものとして一般化するためには、一つでも多くの細胞株で実験・解析を行うことが必要であり、引き続き細胞株の収集を行う。
収集した細胞株を用いて、SS18-SSXの発現、SWI/SNF（BAF）複合体の主要サブユニットの発現、SS18-SSXのノックダウンの実験系の確立、細胞増殖アッセイの実験を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き細胞株の収集を進め、各細胞株におけるSS18-SSXの発現、SWI/SNF（BAF）複合体の主要サブユニットの発現など、生化学的なプロファイルを解析する。また、滑膜肉腫細胞株、SMARCB1欠損悪性腫瘍細胞株、および線維芽細胞などの正常細胞においてSS18、SS18-SSX、SMARCB1の発現を強制的に調節し、主要サブユニットに対する抗体を用いた免疫沈降法により、SWI/SNF（BAF）複合体に関するプロテオーム解析を行う計画である。
【細胞増殖アッセイ】
ノックダウンの実験系、および強制発現の実験系が確立、および遺伝子導入細胞の選択後、コントロールとSS18-SSX KD滑膜肉腫細胞、SMARCB1強制発現滑膜肉腫細胞の増殖能を解析する。解析方法としては、細胞数のカウントやCell Titer-Gloなどのキットを用いた細胞生存率解析、さらにはフローサイトメトリーを用いた細胞周期解析、などを検討している。
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| Causes of Carryover |
与えられた助成金を完全に使い切るのは非常に困難です。頂いている資金と比して、次年度使用額（30,337円）は妥当と考えます。引き続き、研究計画に沿って使用させていただきたく存じます。
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