2018 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis of Siglec-15-DAP12 complex in osteoclast and bone metabolism.
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17K11008
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
北川 教弘 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30294284)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
別所 康全 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (70261253)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 骨代謝 / 糖鎖 / シグナル伝達 / 免疫学 / 破骨細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
成熟破骨細胞形成には、RANKL-RANKシグナル経路とともに、アダプター分子DAP12のITAMを介したシグナル経路が必要である。研究代表者のグループはin vitro分化誘導系を用いた解析から、レクチン分子Siglec-15が破骨細胞形成に必須なDAP会合受容体であることを報告した。また本計画における昨年度までの成果から、1）Siglec-15-DAP12複合体を模倣するキメラタンパク質である改良型SSDKAを構築し、2）本キメラタンパク質を破骨細胞特異的に発現するトランスジェニックマウスの樹立に成功した。また3）本キメラタンパク質の発現によりDAP12遺伝子欠損RAW264細胞由来の成熟破骨細胞形成を回復した、などの成果を上げた。
以上を踏まえて本年度は改良型SSDKAを発現するトランスジェニックマウスとSiglec-15遺伝子欠損マウスを交配し、破骨細胞特異的改良型SSDKAの発現はSiglec-15遺伝子欠損マウスの呈する骨量増加を回復することを見出した。このことはin vivoにおいてもSiglec-15がDAP12会合受容体として機能することを強く示すものである。また改良型SSDKAの発現は、Siglec-15遺伝子を発現抑制したDAP12遺伝子欠損RAW264細胞由来の成熟破骨細胞形成を回復したことから、Siglec-15-DAP12複合体は成熟破骨細胞形成に必要かつ十分である可能性が示された。さらに上記3）を踏まえ、ゲノム編集技術を用いてDAP12遺伝子欠損マウスの作出に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１）破骨細胞特異的改良型SSDKAの発現はSiglec-15遺伝子欠損背景の呈する軽度の大理石骨病を回復することを示すことができた。この結果からSiglec-15が生体骨組織内の破骨細胞でDAP12とともに働くことを強く示唆しえた。計画当初にて本実験は平成29年度に行う予定であったため、予定より一年間遅れている。
２）実験計画当初はSiglec-15-DAP12複合体に会合するタンパク質を同定し、その機能を解析する予定であったが、現時点ではそこに至っていない。前年度に改良型SSDKAの発現がDAP12遺伝子欠損RAW264細胞の多核破骨細胞形成を回復する知見が得られており、Siglec-15が破骨細胞における必要かつ十分なDAP12会合受容体として働くことを強く示唆するものであり、本知見を早急にマウス個体レベルで検証する必要があると考えた。そこでSiglec-15-DAP12複合体会合タンパク質の同定に先行してゲノム編集技術を用いたDAP12遺伝子欠損マウスの作成を試み、実際に樹立するに至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）本研究計画では、Siglec-15遺伝子欠損マウス、破骨細胞特異的に改良型SSDKAを発現するトランスジェニックマウス、およびDAP12遺伝子欠損マウスの3系統をすでに樹立している。本年度はトランスジェニックマウスとDAP12 遺伝子欠損マウスを交配し、DAP12遺伝子欠損背景における改良型SSDKAの発現と骨組織の関連を検討することにより、Siglec-15が破骨細胞において必要かつ十分に機能するDAP12会合受容体である可能性をin vivoにて検証する。検証にはまずμCTによる骨パラメーターの計測を行い、改良型SSDKAの発現による影響が観察された場合、骨形態計測ならびに骨吸収マーカーの測定による生化学的な検討を行う。
2）改良型SSDKAがSiglec-15-DAP12複合体を模倣しうることから、本キメラタンパク質を用いることでSiglec-15-DAP12複合体に会合する機能的なタンパク質の探索を行いうると考えられた。そこで本キメラタンパク質を2-1）Siglec-15遺伝子欠損マウス由来破骨細胞に発現し、細胞外領域に結合するタンパク質の同定を試みる、2-2）DAP12遺伝子欠損RAW264細胞に導入しITAM内チロシン残基のリン酸化特異的に結合するタンパク質を同定する。結合タンパク質の同定にはアフィニティ精製と質量分析を組み合わせて行う。同定された候補タンパク質の機能解析にはRAW264細胞をもとにゲノム編集技術を用いた遺伝子破壊によりin vitro分化誘導系にて検討する。
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| Causes of Carryover |
（理由） 1）本年度までに予定していた骨形態計測の外注および骨吸収マーカー測定を行わなかったこと、また2）DAP12遺伝子破壊マウス作成をSiglec-15-DAP12複合体会合タンパク質の同定に優先させたこと、からこれらに関連する費用を次年度へと繰り越した。
（計画）これまでの成果から改良型SSDKAの発現によりSiglec-15遺伝子欠損マウスが呈する大理石骨病が回復されたことがμCTを用いた解析により示すことができた。本知見をさらに深化させるため骨形態計測および骨代謝マーカーを測定することを計画しており、これに伴う費用にあてる。
また改良型SSDKA会合タンパク質の探索・同定に必要な試薬、学内質量分析サービスの利用に使用する。
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Research Products
(1 results)
