Regulatory system of microRNA and ADAM12 expression in the process of joint remodeling

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11010
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 西田 圭一郎 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (80284058)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大月 孝志 岡山大学, 保健学研究科, 非常勤研究員 (10534802) ; 廣畑 聡 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: miRNA / 軟骨代謝 / メカニカルストレス / ADAM12 / 新規疾患修飾性OA治療薬 / エピジェネティクス

Outline of Annual Research Achievements

前年度のヒト変形性関節症の骨棘およびATDC5細胞を用いた研究で, 軟骨細胞の分化過程で肥大化の前後でADAM12の発現が高値となることがわかった。本年度はATDC5細胞の軟骨分化誘導過程におけるADAM12 KOの影響を検討した。ADAM12-knockout (KO) ATDC5細胞樹立のために, CRISPR/Cas9 systemを用いてsingle guide RNA expression vectors : target site of ADAM12 (5′-GCATCATGAACCCGTCCACG-3′ and 5′-TATTCTGACATCGACGATTG-3′)とCas9プラスミドでDNAを切断し、それらの細胞集団からホモ切断の細胞だけを抽出するためにFACSAria II cell sorter (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) でsingle cell sortingを行った。ホモ切断できている細胞はPCRを行い, シークエンスで確認した。Wild type ATDC5細胞とADAM12 KO ATDC5細胞をDMEM/HAM’s F12 (1%FBSを含む) で培養し、細胞を24 well plateにそれぞれ2.0 ×104 cells/cm2ずつ播種した。次いでreal-time PCRで分化誘導過程中におけるADAM12, IGF-1, RUNX2, Col10a1のmRNA発現をwild type ATDC5細胞とADAM12 KO ATDC5細胞で比較検討した。ADAM12 KO ATDC5細胞では, wild typeと比較して分化誘導過程中にIGF-1の発現は抑制された。一方で, RUNX2の発現は2週目をピークに亢進した。分化誘導後3週と4週、5週目において, ADAM12 KO ATDC5細胞で, wild typeと比較してCol10a1の発現が有意に亢進した。ADAM12 KO ATDC5細胞において, wild typeと比較しwestern blotで3週と4週, 5週目で細胞内のCol10a1の蛋白の発現が亢進した。以上の結果から, ADAM12はX型コラーゲン発現を負に調節し, 軟骨細胞の肥大化に抑制的に働くことが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

患者サンプルを用いた研究では, ADAM12が内軟骨性骨化の過程で軟骨細胞分化における肥大化に関与していることが明らかとなった。また, X型コラーゲン発現との関わりについてはATDC5細胞を用いたin vitroの研究でX型コラーゲン遺伝子の発現の前後でADAM12遺伝子が動いていることが示唆された。本年度はCRISPR/Cas9 systemを用いた遺伝子ノックアウトに成功した。野生型ATDC5細胞との比較により, ADAM12-KOにおいて, X型コラーゲン発現は亢進することから, ADAM12のX型コラーゲン発現に対する抑制的な働きが示唆された。当初の研究計画では, ADAM12はX型コラーゲン発現を促進するとの仮説のもとに研究を開始したため,これを否定する結果の検証に時間を要したが, 全体としては概ね順調であると考えている。

Strategy for Future Research Activity

ADAM12遺伝子のKOは軟骨細胞の肥大化に抑制的に働く可能性があることから, 本年度はATDC5細胞におけるADAM12過剰発現によるIgf-1、RUNX2の発現への影響を検討する。具体的には, 細胞にTGF-β1 (10 ng/mL; Cell signaling Technology, Beverly, MA, USA) を添加し24時間刺激した後にRNAを回収し, wild type ATDC5細胞とADAM12 KO ATDC5細胞とで比較する。さらにATDC細胞において, ADAM12過剰発現ベクターを用いて高発現させ, Igf-1, RUNX2 mRNAの発現に与える影響を検討する。さらに軟骨細胞におけるADAM12発現とmiR-29bとの関連も検討する予定である。

Causes of Carryover

文房具など安価な消耗品は不足しておらず、次年度に繰り越して1000円以上の消耗品費に充てることとした。

Research Products

• [Presentation] 軟骨分化制御による骨棘形成過程へのADAM12の関与 (2017)
  • Author(s): 堀田昌宏, 西田圭一郎, 長谷井嬢, 古松毅之, 宮澤慎一, 那須義久, 中原龍一, 竹下歩, 兼田大輔, 大橋秀基, 尾﨑敏文
  • Organizer: 第32回日本整形外科学会基礎学術集会