2018 Fiscal Year Research-status Report

骨・軟骨に発現するコラーゲン分子群の骨格形成作用機序の解明と組織再生への応用

Research Project

Project/Area Number	17K11015
Research Institution	Oita University
Principal Investigator	松尾哲孝大分大学, 医学部, 准教授 (10284788)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	佐々木隆子大分大学, 医学部, 助教 (30133193)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	コラーゲン / 転写 / 骨 / 軟骨
Outline of Annual Research Achievements	１）XI/XXVII型コラーゲン遺伝子の軟骨特異的発現調節機構の検討。２つの軟骨エンハンサーの生体内機能を明らかにするためにトランスジェニックマウスを解析する。更に、XI型の軟骨エンハンサーの近傍にサイレンサーの存在を見出し、抑制因子の結合阻害によりエンハンサー活性を増強したので、抑制因子をBioinfomatics・転写因子スクリーニング、Chip assay等で同定する。XXVII型コラーゲンのエンハンサー領域について、ルシフェラーゼassay・EMSA、Chip assay、アフィニティーカラム精製によるTOF-MS解析等で調節領域・因子を同定する。２）V/XXIV型コラーゲン遺伝子の骨特異的発現調節機構の検討。マウス胎児・生後のマウス手足先にエレクトロポレーションを用いてSp7/Osterix発現・ノックダウンベクターを導入し、生体内での骨組織調節機構を解析する。一方、XXIV型は、トランスジェニックマウス解析により下顎骨に弱いシグナルを検出したので、骨芽細胞に対する網羅的スクリーニング法を行い、骨特異的シスエレメント領域の同定を検討する。３）non-coding RNA制御によるV/XIおよびXXIV/XXVII型コラーゲン分子発現メカニズムについての検討。骨芽細胞におけるmiRNA29のV型コラーゲン発現抑制を見出したので、その作用機序を、Northern blotting・ルシフェラーゼアッセイ等で明らかにする。組織によりプロモーター構造が異なり特異性が認められたので、転写因子と複合体を形成し発現を調節するlong ncRNAに着目し、V/XI・XXIV/XXVII型のプロモーターに関与するlncRNAを、Lnc-PCR（Lnc Profiler qPCR）、マイクロアレイ、次世代シーケンサー等を用いて同定し、その作用機序を明らかにする。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason １）XI/XXVII型コラーゲン遺伝子の軟骨特異的発現調節機構の検討。２つの軟骨エンハンサーの生体内機能を明らかにするためにトランスジェニックマウスによる解析が、遺伝子導入がうまくいっていない。XI型の軟骨エンハンサーのサイレンサーおよびエンハンサー活性因子の同定が進行中である。２）V/XXIV型コラーゲン遺伝子の骨特異的発現調節機構の検討。、XXIV型の骨特異的シスエレメント領域の同定が進行中である。３）non-coding RNA制御によるV/XIおよびXXIV/XXVII型コラーゲン分子発現メカニズムについての検討。骨芽細胞におけるmiRNA29のV型コラーゲン発現抑制を見出したので、その作用機序を、Northern blotting・ルシフェラーゼアッセイ等で明らかにする。組織によりプロモーター構造が異なり特異性が認められたので、転写因子と複合体を形成し発現を調節するlong ncRNAに着目し、V/XI・XXIV/XXVII型のプロモーターに関与するlncRNAの同定を試みているが、未だ特定できていない。
Strategy for Future Research Activity	１）XI/XXVII型コラーゲン遺伝子の軟骨特異的発現調節機構の検討。２つの軟骨エンハンサーの生体内機能を明らかにするためにトランスジェニックマウスによる解析については、引き続き検討すると共に、XI型の軟骨エンハンサーのサイレンサーおよびエンハンサー活性因子の同定についても早急に進める。２）V/XXIV型コラーゲン遺伝子の骨特異的発現調節機構の検討。、XXIV型の骨特異的シスエレメント領域の同定も平行して早急に行う。３）non-coding RNA制御によるV/XIおよびXXIV/XXVII型コラーゲン分子発現メカニズムについての検討。転写因子と複合体を形成し発現を調節するlong ncRNAに着目し、V/XI・XXIV/XXVII型のプロモーターに関与するlncRNAを、網羅的にスクリーニングして同定を目指す。
Causes of Carryover	骨・軟骨特異的発現調節領域および調節因子の同定が予定どおりに進行していない。同様に、V/XI・XXIV/XXVII型のプロモーターに関与するlncRNAの同定を試みているが、未だ特定できておらず、現在進行中である。以上の状況を考慮して、消耗品等は、実験進行に合わせて購入する方がゆうこうであると考え、予算を繰り越して使用することにした。