2018 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of Tmem161a function in bone metabolism using the exchangeable gene trap mutagenesis
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17K11017
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
関本 朝久 宮崎大学, 医学部, 講師 (60305000)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
帖佐 悦男 宮崎大学, 医学部, 教授 (00236837)
舩元 太郎 宮崎大学, 医学部, 講師 (20404452)
荒木 正健 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (80271609)
荒木 喜美 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (90211705)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Tmem161a遺伝子 / 骨代謝機能 / 可変型遺伝子トラップ法 / ロコモティブシンドローム / モデルマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、骨粗鬆症などのロコモティブシンドロームの病因・病態解明のために、『可変型遺伝子トラップ法』により樹立した変異マウス系統を用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子探索の効率的なスクリーニングを実施している。我々はそれらトラップクローンデータをデータベース『EGTC』(http://egtc.jp) に公開し、骨軟骨代謝に異常をきたす疾患モデルマウスライブラリーを構築中である。現在このEGTCデータベースに登録したクローンから、特に骨軟骨にトラップした遺伝子の発現のみられるクローンを選別し、その遺伝子欠損マウスを作製して骨軟骨表現型および遺伝子機能を解析している。
そのライブラリーマウスの中で、Tmem161a (Transmembrane 161a) 遺伝子欠損マウスは、骨軟骨スクリーニングにおいて、マイクロCTおよび骨形態計測では明らかな骨量増加を認め、骨力学試験では骨強度増大、そして病理組織では骨軟骨組織異常を示す骨表現型を呈していた。しかしながら、これまでin vivoでの骨代謝における機能について報告例はない。
現在我々はTmem161a遺伝子欠損トラップマウスを用いて、将来の骨粗鬆症治療への可能性を見据えて、Tmem161a遺伝子の骨代謝を中心とした詳細な機能解析を遂行している。昨年度の結果より、Tmem161aは骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと報告した。今年度は昨年度に引き続きTmem161a欠損トラップマウス解析を施行し、2次スクリーニング（マイクロCT、骨形態計測、骨力学試験、病理組織解析）を個体数や計測時期を増やして解析を行った。さらに骨代謝関連遺伝子群のリアルタイムPCR、アリザリンレッド・トルイジンブルー等骨組織染色各種、透過型電子顕微鏡解析や、in vitroにおける初代骨芽細胞培養実験等も実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在我々はTmem161a遺伝子トラップクローンからホモ・ヘテロ接合体マウスを作製し、骨軟骨表現型を解析している。
昨年度は、Tmem161a欠損トラップマウスにおけるvector insertion point解析、ゲノム構造解析、導入遺伝子の組織発現(X-gal染色)解析、マウス個体の遺伝子型解析、出生率、体重、生存日数調査、大腿骨のマイクロCT解析の結果から、Tmem161aは骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと報告した。今年度は昨年度に引き続きTmem161a欠損トラップマウス解析を施行し、2次スクリーニング（マイクロCT、骨形態計測、骨力学試験、病理組織解析）を個体数や計測時期を増やして解析を行った。さらに骨代謝関連遺伝子群のリアルタイムPCR、アリザリンレッド・トルイジンブルー等骨組織染色各種、透過型電子顕微鏡解析や、in vitroにおける初代骨芽細胞培養実験等も実施した。
Tmem161a欠損トラップマウス表現型解析における結果は、ホモマウスはμCTにて著明な骨量増加を認め、骨形態計測では骨塩量、皮質骨厚や海綿骨厚、骨梁数が有意に増加し、骨力学試験でも有意に骨強度（最大点試験力・応力、破断点試験力・応力）の増大を認めた。リアルタイムPCRではBMP4やRunx2の発現が有意に高値であった。脛骨のアリザリンレッド染色では1次海綿骨骨梁の石灰化亢進を認め、トルイジンブルー染色では肥大軟骨細胞層の配列異常を認めた。透過型電子顕微鏡解析では、骨芽細胞の形態異常を認めた。初代骨芽細胞培養ではRunx2やOsterixの発現亢進を認め、ALP染色やアリザリンレッド染色では石灰化の亢進を認めた。今回のTmem161a欠損マウスの解析により、Tmem161aは骨芽細胞の機能発現に重要な機能を担っている可能性が高いと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Tmem161aは酸化ストレスに関与するタンパクのひとつであり(Montesano, 2006)、骨代謝障害の要因は酸化ストレスの亢進も関与することから、骨代謝においても重要な遺伝子である可能性が考えられる。しかしながら今回の研究対象であるTmem161aの骨代謝における機能は未だ不明で、さらにノックアウトマウスを用いたin vivoでの報告は無く、これまで骨組織、骨代謝に言及した報告は皆無である。
また、我々のTmem161aトラップマウスに特徴的なことは、ホモマウスはnullで、短命ではなく生後一定期間生育可能であり、かつ明らかに骨形成能が亢進している。また出産も可能である。このためin vivoでホモマウスの実験が可能であるというメリットがある。したがって、今後もTmem161a遺伝子欠損トラップマウスを用いて、その骨代謝における機能を解析して行く計画である。既にTmem161a欠損トラップマウスは骨軟骨1次スクリーニング (EST profile、X-gal染色)、2次スクリーニング (マイクロCT、骨形態計測、骨力学試験、病理組織解析)、さらには初代骨芽細胞培養で骨表現型異常を呈していた為、Tmem161aは骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと考えられる。今後は上記と共に更にTmem161aトラップマウスのin vitroにおけるMC3T3細胞を用いたRNAi解析、CRISPR/Cas9 ノックアウト解析、酸化ストレス・小胞体ストレス負荷による細胞ストレス応答実験等を進めて行く計画である。
本研究によりTmem161aの骨代謝における機能を解明できると考えられる。さらに我々が作製したTmem161a欠損マウスは、バイオリソースとして骨粗鬆症治療薬開発などの様々な研究分野での有効活用が期待できる。
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