β-cateninを標的とした未分化性制御による新規多能性幹細胞の作製法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11037
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 竹原 俊幸 近畿大学, 医学部, 助教 (60580561)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寺村 岳士 近畿大学, 医学部附属病院, 講師 (40460901) ; 福田 寛二 近畿大学, 医学部, 教授 (50201744) ; 末盛 博文 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 准教授 (90261198)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ヒト多能性幹細胞 / β-catenin / iPS細胞 / ES細胞 / 基底状態

Outline of Annual Research Achievements

再生医療の実現には、多能性幹細胞の利用が必須であると考えられている。ところが近年、ヒトES細胞・iPS細胞は、多くの問題を抱えていることが知られている。例えば、ゲノムの不安定性や分化能力の低さなど臨床応用への実現には大きな障害となっている。これらの原因は、ヒト多能性幹細胞が「分化傾倒状態（primed型）」であることが知られている。そこで、本研究では、分化傾倒状態であるヒト多能性幹細胞を基底状態へと転換させる技術の開発を試みた。
β-cateninは、組織発生や細胞運動などあらゆる細胞動態に関わる分子として知られ、細胞状態に依存してその機能が変化することが示されている。多能性幹細胞では、β-cateninが基底状態の獲得に重要な機能を担っていると示唆される研究報告はあるが、詳細な機序は分かっていない。本研究では、β-cateninの修飾状態の違いに着目し、β-cateninの機能変化と基底状態ヒト多能性幹細胞の関係性を検討した。
平成30年度では、昨年度に引き続きβ-catenin-lysine49の活性化を誘導することによる細胞性質への変化を観察した。基底状態マーカーの一つであるOct4 deltaPE-GFPの発現を観察したところ、GFP陽性細胞の出現が観察された。また、β-catenin-lysine49活性化により得られたヒト多能性幹細胞の性質をより詳しく評価するため、MicroarrayおよびRNA-seq解析を行った。その結果、従来のprimed型ヒト多能性幹細胞とは異なった性質を有しており、基底状態のマーカー遺伝子群の発現が上昇していることが示された。さらに、得られた細胞は従来のヒト多能性幹細胞と比べ低メチル化状態を示した。以上の結果から、β-catenin-lysine49の活性化は基底状態の獲得において重要な因子のひとつであることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度では、β-cateninの特定部位の修飾状態：lysine49のアセチル化を人為的に活性化させることで、分化傾倒状態のヒト多能性幹細胞を基底状態へと誘導できる可能性が示された。β-cateninという普遍的な分子を正しく制御することで、従来のヒト多能性幹細胞が持つ弱点を克服できる新たな幹細胞制御法であると考えられる。また本研究の結果は、β-cateninの多様な（細胞・空間・時期特異的な）機能に対する知見として、それらの機能は翻訳後修飾によって引き起こされている可能性が示された。また、β-cateninは様々な種保存性が高く、ヒト以外の種においても同様な機能を保有していることが容易に想像できるため、ヒトを含めた霊長類あるいはブタやウマなどの動物種への適用が期待できる。
最終年度ではより発展させた研究として、β-catenin lysine49の活性化がどのようにして基底状態に関わる遺伝子発現調節を行っているのかを明らかにする。また、本研究の狙いである異なる動物種においても同様にβ-catenin lysine49のアセチル化によって基底状態を導くことができるかを検討するため、カニクイザルあるいはウサギES細胞を材料に検討を行う予定である。研究は予定どおり実施しているため、概ね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

31年度も計画通り研究を進める予定である。
β-catenin lysine49の活性化による選択的な遺伝子発現制御メカニズムの解明を試みる。30年度の実験結果より、β-catenin lysine49の活性化によって発現促進あるいは抑制される遺伝子群を制御すると考えられる遺伝子候補が得られている。この遺伝子候補は基底状態と密接な関係があることが知られている。そこで、β-catenin lysine49活性化による遺伝子制御機構を明らかにし、基底状態の獲得に対する知見を得る。また、β-cateninの特徴のひとつである種保存性に着目し、カニクイザルあるいはウサギES細胞を用いて同様にβ-catenin lysine49活性化による基底状態多能性幹細胞の誘導を行い、その性質評価を実施する。以上の研究計画を進めることで、β-cateninの修飾状態に着目した多能性幹細胞における遺伝子発現制御メカニズムの解明を試みる。

Causes of Carryover

30年度において、基底状態であると考えられるヒト多能性幹細胞の作出が可能であった。そこで、31年度では、得られた知見をもとに、より踏み込んだ実験計画としてβ-cateninのパートナー因子の解明とその役割について網羅的に解析し、β-cateninを中心とした遺伝子発現制御機構を明らかにする。また、上記の研究と並行し、ヒト以外の種（カニクイザルあるいはウサギ）において基底状態多能性幹細胞の誘導を行う予定である。
計画書
31年度では、ヒト多能性幹細胞の培養に加えてカニクイザルおよびウサギES細胞の培養を行うため、細胞培養試薬や遺伝子導入試薬の購入を予定している。また性質評価として、遺伝子発現解析およびタンパク質発現解析に関連した試薬の購入を予定している。また、RNAシークエンスおよびクロマチン免疫沈降シークエンスといった大規模解析を行うことでβ-cateninの機能を正確に解析し、新たなパートナー因子の同定を計画している。