2017 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子改変動物によるオキシトシン疼痛・炎症関連下行系の可視化・定量化の試み
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17K11039
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| Research Institution | University of Occupational and Environmental Health, Japan |
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Principal Investigator |
鈴木 仁士 産業医科大学, 医学部, 助教 (80644880)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上田 陽一 産業医科大学, 医学部, 教授 (10232745)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | オキシトシン / 単量体赤色蛍光 / トランスジェニックラット / CRPSモデル / 坐骨神経部分結紮 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
成熟雄性オキシトシン（OXT）-単量体赤色蛍光タンパク1（mRFP1）トランスジェニックラットを用いて右側坐骨神経を部分結紮し、CRPSモデルを作成した。無処置群と偽手術群を対照群とし処置後７日に実験を行った。処置前後の痛覚閾値をvon Freyテストで確認したところ坐骨神経部分結紮群で有意に低下していた。その後、灌流固定し、脳および脊髄を採取した。下垂体後葉（PP）は採取後、蛍光顕微鏡を用いてmRFP1の発現を観察した。ホルマリン固定後、ミクロトームを用いて視索上核（SON）、室傍核（PVN）および第５腰髄（L5）脊髄後角を含む30μmの切片を作成。その後、免疫組織化学的染色法でFosタンパクを緑色蛍光で標識し、蛍光顕微鏡でSONおよびPVNにおけるmRFP1ならびにFosタンパクの発現を観察した。PVNは大細胞領域（mPVN）と小細胞領域（pPVN）に分けて検討した。さらに患側L5脊髄後角Ⅰ-Ⅱ層におけるmRFP1陽性分泌顆粒数を観察した。その結果、mRFP1平均輝度は観察した全ての領域で坐骨神経部分結紮群で対照群と比較し有意に増加していた。脊髄後角におけるmRFP1陽性分泌顆粒数も坐骨神経部分結紮群で有意に増加していた。処置後7日ではFosタンパクの発現は確認できなかったためmRFP1輝度の経時的変化を確認する事とし、処置後1日ならびに14日で同様の実験を行った。処置後14日の結果は全ての項目で処置後7日と同様だった。処置後1日の痛覚閾値は各群間で有意差を認めなかった。mRFP1平均輝度はPPで坐骨神経部分結紮群と偽手術群で無処置群と比較し有意に増加していた。SONおよびpPVNで坐骨神経部分結紮群で対照群と比較して有意に増加していたが、mPVNでは有意差を認めなかった。脊髄後角におけるmRFP1陽性分泌顆粒数は坐骨神経部分結紮群で無処置群と比較してのみ増加していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(平成 29 年度) は、OXT-mRFP1トランスジェニックラットを用いたCRPSモデルの実験を行い、視床下部および脊髄後角のOXT-mRFP1の赤色蛍光の可視化・定量評価を行った。Fosタンパクを指標に活性化したニューロンの確認を試みたが、処置後7日でFosタンパクの発現を認めなかったため処置後1日および14日の追加実験を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度（平成 30 年度）においては、実際にCRPSモデルにおいてOXT合成が増加していることを証明するために、OXTならびにmRFP1のmRNAが増加していることを確認する。OXT-mRFP1トランスジェニックラットを用いて処置後7日で断頭を行い、クリオスタットを用いて12μmの切片を作成しin-situハイブリダイゼーションを行う。
また、脊髄後角の抑制性介在ニューロンを抗 GABA 抗体もしくは抗 GAD 抗体による免疫組織化学的染色法を用いて緑色蛍光で可視化する。蛍光顕微鏡を使用し、脊髄後角Ⅰ-Ⅱ層における オキシトシン-mRFP1 蛍光陽性の分泌顆粒を含むオキシトシンニューロンの軸索が GABA もしくは GAD 陽性細胞に投射するか確認する。
本研究の成果は、日本生理学会、日本整形外科学会などの国内学会および国際学会に発表し、国際専門誌に英文論文として発表する予定である。
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[Presentation] Fluorescent visualization of oxytocin neurons activated by acute nociceptive stimuli in the c-fos-eGFP transgenic rats2017
Author(s)
Yasuhito Motojima, Haruki Nishimura, Takanori Matsuura, Mitsuhiro Yoshimura, Hirofumi Hashimoto, Reiko Saito, Hiromichi Ueno, Takashi Maruyama, Satomi Sonoda, Kazuaki Nishimura, Kentaro Tanaka, Hitoshi Suzuki, Makoto Kawasaki, Hideo Ohnishi, Akinori Sakai, Yoichi Ueta
Organizer
Fourth World Congress of Reproductive Biology
Int'l Joint Research
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