成熟型延髄呼吸中枢におけるノシセプチンの役割と責任部位の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11042
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 瀧田 恒一 北海道大学, 大学病院, 講師 (80261311)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 呼吸中枢 / 呼吸リズム形成 / ノシセプチン

Outline of Annual Research Achievements

平成30年度は、前年に引き続き、ノシセプチンの呼吸中枢における役割解明のための成熟型呼吸中枢解析モデルとしてのラットworking heart brainstem preparation の確立を目指した。年度途中まで、標本から呼吸活動を引き出すことは、困難であった。このため、本標本が確立されている、昭和大学歯学部生理学教室で実験を見学させていただいた。昭和大学での実験を参考に実験方法を修正し（後述）、また灌流部位を下行大動脈から上行大動脈に代えることにより、横隔神経からの電気活動の記録ができるようになった。［標本の作製］前年度まで、0℃の人工脳脊髄液中で標本作成を行ったが、標本のviabilityが悪い可能性として、人工脳脊髄液の温度が低すぎる可能性を考えたが、この点は否定された。灌流カニューレは、22Gの静脈留置カテーテルを使用していたが、圧ラインを必要としたこともあり、17G 中心静脈用ダブルルーメンカテーテルを加工したものに変更した。本年度途中まで、下行大動脈からの灌流を行っていたが、心尖部からカテーテルを挿入し、大動脈弁上から灌流することにより、標本のviabilityは著しく向上した。［灌流システム］標本を灌流液に水没させたほうが、横隔神経の吸引が容易であるため、灌流バスを作り直した。灌流量が少ない可能性を考え、灌流ポンプを、高流量灌流（>30ml/分）できるポンプに代えた。［記録システム］灌流圧のモニタのため、圧測定を記録システムに組み込んだ。現在2時間以上の安定記録のため、手技向上に努めているところである。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

平成30年度は、ラットworking heart brainstem preparation からの横隔神経活動電位の長時間安定した細胞外電位記録の確立および脳幹からの呼吸関連ニューロンの記録の確立を目指したが、技術的に難度が高く、横隔神経からの電気活動を記録するにとどまった。したがって、進捗状況としては当初予定より遅延している。

Strategy for Future Research Activity

平成31年度は、（１）3－7週齢ラットのworking heart brainstem preparation から横隔神経活動電位を記録し、ノシセプチン作動薬、拮抗薬の灌流液投与による呼吸リズムの変化を検討する。　（2）免疫組織化学法あるいはin situ hybridization法により、ノシセプチン受容体の呼吸関連ニューロン内局在を明らかにする。呼吸関連ニューロンの同定は、当初細胞内電位記録での細胞内染色による予定であったが、細胞内電位記録が、技術的に困難であるため、呼吸関連ニューロンに特異的なマーカ蛋白を免疫組織染色することによりマーキングする予定である。以上による手法で、ノシセプチンの成熟型呼吸中枢での役割、その責任部位を明らかにできると考える。

Causes of Carryover

経費の節約により生じた未使用額87413円については、次年度の成熟型延髄呼吸中枢におけるノシセプチンの役割と責任部位の解明のための、ラットworking heart brainstem preparation作成のための動物（生後3-7週Wistarラット）および灌流液作成薬品の購入に使用する。