2017 Fiscal Year Research-status Report
一過性の脳虚血障害が脳内アミロイドβ代謝と認知症発症に与える影響についての検討
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17K11084
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
閔 莉娟 愛媛大学, 医学部附属病院, 助教(病院教員) (80726175)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
茂木 正樹 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (20363236)
堀内 正嗣 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (40150338)
岩波 純 愛媛大学, 医学系研究科, 助教 (90624792)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 脳虚血 / 脳血管障害 / Aβ投与 / 血管老化 / 認知障害 / AT2受容体 / 炎症・酸化ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
[目的] 本研究では脳虚血が脳血管の老化とAβクリアランスに影響し、Aβにより認知機能障害を悪化させるとの仮説を立て、アンジオテンシンIIに着目して検討することを目的とする。
[方法] In vivoでは、野生型マウス及び血管平滑筋細胞特異的にAT2受容体を過剰発現するマウス(SMAT2-Tg)を用い、Aβ脳室内投与および一過性全脳虚血（Aβ-虚血）モデルマウスを作成して検討を行った。投与3週間後にモリス水迷路試験にて空間認知機能を評価した。In vitroでは、野生型マウスの脳血管平滑筋細胞（BVSMC）の初代培養系を用い、アンジオテンシンIIやAβ1-40で連日刺激し、老化関連βガラクトシダーゼ染色により細胞老化を評価した。
[結果] 野生型マウスにおいて、Aβの投与では認知機能の低下が認められた。虚血のマウスでは顕著な認知機能の低下は認めなったが、興味深いことに、Aβ-虚血マウスではAβ投与マウスと比べて、認知機能がさらに低下した。このAβ-虚血による認知障害には炎症性サイトカインのMCP-1、IL1-βやNADPHオキシダーゼサブユニットのp22phox、p40phoxの発現の増加とNADPHオキシダーゼ活性の増強が影響することが認められたが、血流変化とAβ沈着の影響が認められなかった。一方で、SMAT2-Tgにおいてはこの認知障害の悪化、炎症や酸化ストレスの増加が認められなかった。野生型マウスのBVSMCにおいて、単独刺激では老化を誘導しない低濃度のアンジオテンシン IIとAβの併用刺激により老化細胞が明らかに増加した。この相乗作用には酸化ストレスの増加、p-ERK/p16/pRb経路の活性化が関連していることが分かった。
[考察] 脳虚血はAβ投与により認知障害を悪化させることが示唆された。そのメカニズムとしては、脳血管老化の促進、脳内の炎症や酸化ストレスの増加などが関与している可能性が考えられた。血管におけるAT2受容体の活性化はこの認知障害を抑制する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在まではほぼ予想の通りに進めております。In vivoの実験では、Aβ-虚血では血流の変化は認められなかった。その理由としては、１つは用いたモデルマウスは手術後から経過した時間が長かったので、血流が大体元の状態に戻した。も一つ理由は実際に血流が変化しない。Aβ-虚血により血管の傷害は血流変化以外に、単純な血管内皮の結構、機能の変化があることが言われている。また、いろいろな抗体を使って、いくつの免疫染色法にてAβの沈着を検討したところ、すべてのグループの脳組織や脳血管中にAβの沈着を認められなかった。以前の研究では、注射されたAβは時間依存的に徐々にクリアされ、注射の6日後にほぼすべてのAβが消失したことが報告された。さらに、ICVマウスモデルにおいてAβの原線維プラークを示さなかった。こうしたら、Aβ注射モデルマウスを使用した場合、アミロイド沈着の評価は非常に困難であると思われる。一方、いくつの研究データはAβ蓄積の交替よりもむしろAβ自身の誘発毒性が神経細胞を傷害させて、認知障害を惹起することが示唆された。
現在は、In vivoでは、酸化ストレスについて、dihydroethidiumによるスーパーオキシドアニオンの産生を検討している。また、神経細胞の障害は蛍光免疫染色法にて検討している。In vitroでは、シグナル伝達機構について、NF-κB、IκBの活性はluciferase activity assayで検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後以下のようにさらにメカニズムに焦点を当てた検討が進める：
In vivo: 脳血管内のAβの血管クリアランス関係因子RAGE、LRP-1の発現に注目して、リアルタイムRT-PCR法やウエスタンブロット法にて検討する。脳組織中のAβ濃度はELISA法にて測定する。また、神経細胞の障害について、pyknosisを着目して、HE染色法で評価する。脳血管損傷について、脳血管の老化をSA-β-gal染色法にて確認する。また、オートファジーのinducerであるRapamycin や阻害薬である3-methyladenineの投与による認知機能への影響や脳中のAβ濃度を比較検討する。以上の検討は変化が認められた場合、AT2受容体欠損マウスやAT2受容体過剰発現マウスも用い、Aβ投与後の一過性全脳虚血モデルマウスを作製し野生型マウスと以上の検討を比較する。AT2受容体のシグナルについてはPPAR-gammaの活性も含めて検討して行く。
In vitro: シグナル伝達機構について、ERK inhibitor U0126を使って、老化細胞の数、p16の発現とRbの活性を検討する。AβとAng IIにより誘導された老化BVSMCを用い、Aβの血管に取り込み過程に関わる受容体RAGE、LRP-1の発現をウエスタンブロット法にて検討する。また、老化したBVSMCにおけるAβの取り込み能を調べるため、AβとAng IIで誘導した老化BVSMCに125Iで標識したAβ1-40を添加し、10分間の細胞内Aβの取り込み量をγシンチレーションカウンターにてCell/Medium ratioで評価する。次に、老化したBVSMCよりAβの分解能力を調べるため、AβとAng IIで誘導した老化BVSMCを通常の培養ミディアムに戻し、48時間後の培養メディウム中のAβ濃度をELISA法にて測定する。以上の検討は変化が認められた場合、AT2受容体欠損マウスやAT2受容体過剰発現マウス由来のBVSMCも用い、野生型マウス由来のBVSMCと比較し検討する。
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[Journal Article] Beneficial Effect of Mas Receptor Deficiency on Vascular Cognitive Impairment in the Presence of Angiotensin II Type 2 Receptor2018
Author(s)
Higaki A, Mogi M, Iwanami J, Min LJ, Bai HY, Shan BS, Kukida M, Yamauchi T, Tsukuda K, Kan-No H, Ikeda S, Higaki J, Horiuchi M
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Journal Title
J Am Heart Assoc.
Volume: 7
Pages: pii: e008121
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Predicting outcome of Morris water maze test in vascular dementia mouse model with deep learning2018
Author(s)
Higaki A, Mogi M, Iwanami J, Min LJ, Bai HY, Shan BS, Kukida M, Kan-No H, Ikeda S, Higaki J, Horiuchi M
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Journal Title
PLoS One
Volume: 13
Pages: e0191708
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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