2017 Fiscal Year Research-status Report

統合オミックス解析をもちいたGGCT発現阻害による抗腫瘍メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	17K11131
Research Institution	Shiga University of Medical Science
Principal Investigator	窪田成寿滋賀医科大学, 医学部, 非常勤講師 (80759118)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	礒野高敬滋賀医科大学, 実験実習支援センター, 准教授 (20176259) 影山進滋賀医科大学, 医学部, 講師 (50378452) 吉田哲也滋賀医科大学, 医学部, 助教 (60510310) 河内明宏滋賀医科大学, 医学部, 教授 (90240952)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	γ-グルタミルシクロトランスフェラーゼ / トランスクリプトーム解析 / メタボローム解析 / 増殖抑制機構
Outline of Annual Research Achievements	GGCT(γ-glutamylcyclotransferase)はグルタチオン代謝に関わる酵素であり、正常組織での発現は極めて低いが、種々の癌腫での高発現が報告されている。発現阻害により癌細胞特異的な抗腫瘍効果を認め、治療標的として極めて有望な癌関連蛋白であるが、その細胞増殖抑制機構については解明されていない。本研究は、GGCT発現阻害による抗腫瘍メカニズムを統合オミックス解析の手法を用いて解明し、新規抗癌化学療法の確立へ繋げることを目指すものである。初年度はGGCT高発現細胞株である乳癌由来MCF-7を試料としてGGCTノックダウン細胞と対照細胞（ネガティブコントロール配列）を準備し、トランスクリプトーム解析とメタボローム解析を行い比較検討した。トランスクリプトーム解析では、GGCT発現阻害により細胞周期関連遺伝子群の有意な発現低下とストレス応答性細胞内シグナル伝達系の遺伝子群の発現上昇を認めた。前者では主にG1/S期の移行制御に関与する複数のCDK阻害因子（ink4、cip/kipファミリー）の発現上昇とcyclin-CDK複合体の顕著な発現低下を認め、FACSによる細胞周期解析においてもG1/S細胞周期停止の誘導を確認した。以上よりGGCT発現阻害により生じる細胞内ストレスが細胞周期制御因子の上流の細胞内シグナル伝達を活性化し、細胞周期停止に寄与していることが示唆された。メタボローム解析では、グルタチオン合成経路であるγ-グルタミル回路において、グルタチオン及びその基質となるシステインの著明な減少を認め、GGCT発現阻害により惹起される細胞内カスケードの起点が酸化ストレスである可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 初年度の計画内容として予定したGGCTノックダウン細胞に対する次世代シーケンサーを用いたトランスクリプトーム解析及びメタボローム解析を実施し、遺伝子や代謝産物について対照サンプルとの定量比較や候補遺伝子及びパスウェイリストの作成に着手することができた。メタボローム解析に関しては一部解析が遅れており、鋭意推進中である。
Strategy for Future Research Activity	トランスクリプトームデータとメタボローム解析結果を統合し、GGCT発現阻害により惹起される細胞内カスケードを明らかにするための検証を引き続き行う。GGCT発現阻害により生じる細胞内ストレスとして酸化ストレスに着目しており、GGCTノックダウン細胞におけるROSレベルの変動や酸化ストレス関連細胞死との関連を検証する。その他、細胞周期及び細胞増殖シグナル伝達系のパスウェイでの発現変動が大きい遺伝子を候補遺伝子として選定し、定量的RT-PCR、Western blotなどによる発現解析やRNA干渉実験による細胞増殖抑制効果の確認を行う。MCF-7における細胞内カスケードが明らかになれば、他のGGCT高発現細胞株(前立腺癌由来PC3、膀胱癌由来RT112など)に対しても同様の増殖抑制機構が働くかを検証する予定である。
Causes of Carryover	試薬、消耗品などに以前の購入物品を充当したため、当初予定使用額との差異が生じたが、次年度への繰越分は、当初の使途目的のとおり検証実験に用いる試薬及び検体の購入などに充当して使用する。