2019 Fiscal Year Annual Research Report
The identification of CUL3-SPOP and CUL3-PLZF target substrates for therapeutic targets in prostate cancer cells
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17K11142
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
菊川 忠彦 愛媛大学, 医学系研究科, 准教授 (70444734)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
雑賀 隆史 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (10314676)
東山 繁樹 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (60202272)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 前立腺がん / ユビキチンリガーゼ / SPOP / 質量分析法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前立腺がんと正常組織のエキソーム配列決定から、前立腺がんの約15％にSPOP変異が認められ、この変異が前立腺がんの新しい分子サブタイプの特徴となっている。SPOPはCullin3(CUL3)型E3ユビキチン(Ub)リガーゼ複合体の基質受容体であるが、変異SPOPは基質結合能を失うと考えられている。しかし、変異SPOPを持つ前立腺がん細胞での基質タンパク質の量的変動の実態は明らかにはされていない。平成30年度までにSPOPの基質候補分子として124種を同定、全リコンビナントタンパク質を合成後、質量分析により検出可能なペプチド（プロテオタイピックペプチド、PTP）を同定した。124分子中101分子については PTPを決定できたが、残り23種に関しては適切な PTP検出には至らなかった。そこで平成3１年度は、101分子のPTPをタンデムに繋ぎ合わせた人工タンパク質をコードするcDNAをデザインし、これを鋳型としてコムギ胚芽細胞タンパク質合成系で安定同位体標識人工タンパク質QconCAT (Quantification Concatamer)を合成した。本QconCATのトリプシン分解並びに質量分析において、目的とする全てのPTPの検出をまず確認した。これを絶対定量用標準タンパク質として、また、ヒト前立腺がん培養細胞株C4-2細胞及びPC-3細胞の可用性画分を試料として101の基質分子の定量を四重極質量分析系を用いた選択的モニタリング反応 (SRM)により定量解析を行なった。しかし、アンドロゲン受容体を含む101の基質候補分子のどのシグナルも検出限界レベルであり、優位なシグナルを得ることはできなかった。問題点として、細胞可用性画分における全基質候補分子の含量がきわめて低く、また夾雑物が多すぎることが考えられる。現在これらの点を改良しているところである。
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