2017 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of pathophysiology and biomarker discovery for prostate cancer in the lipid-deficient hypoxia microenvironment
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17K11168
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| Research Institution | Kanagawa Cancer Center Research Institute |
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Principal Investigator |
宮城 洋平 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, 総括部長 (00254194)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小井詰 史朗 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, その他 (60416063)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 前立腺がん / 低酸素 / 低栄養 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らが見出した「がん組織の脂質欠乏低酸素環境」において特異的に発現誘導される分子は，がんの進行度が予測できるマカーとして、治療対応が必要な初期進行前立腺がんの診断マーカー／治療分子標的となる可能性がある．本年度は、「脂質欠乏低酸素環境」で発現誘導される遺伝子群から、低酸素ｘ低脂質で相乗的に10倍以上の発現誘導が起こる7回膜貫通のGタンパク質共役型受容体分子（仮称：GPCR-X）に着目して研究を進めた。
GPCR-Xについては、前立腺がんに関する研究は殆どなく、また、蛋白質レベルの研究が殆どされていない。そこで、市販されている４種類の抗体を購入、RNA発現解析でGPCR-X mRNAの発現が低酸素・低脂質条件で誘導されるLNCaP細胞のLysateで、Western Blot を実施したが、いずれの抗体もGPCR-Xタンパク質を検出することはできなかった。一般的に、GPCRタンパク質の強制発現や抗体作製は困難であるとされている。そこで、Western Blot や免疫染色ができる抗GPCR-X抗体が作製できれば、研究が飛躍的に進むと判断し、抗体作製を試みた。２種類の新規ペプチド、1種類の組換え大腸菌タンパク質を作製、兎に免役して3種類のポリクローナル抗体を作製した。抗原に反応する抗体はできたが、LNCaP細胞のWestern Blot ではGPCR-Xタンパク質を検出することはできなかった。一方、RNAscopeを用いたIn Situ Hybridizatonでは、LNCaP Xenograft、ヒト前立腺癌組織で、HIF-ialpha免疫染色で見出した低酸素領域周辺に、GPCR-X mRNAの陽性所見が検出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
低酸素低栄養状態での発現誘導の強度、と、これまでに研究が進んでいない新規性、を考慮してGPCR-Xを標的として研究に着手した。他分野（神経科学）での研究報告があり、抗体も複数市販されているが、Western Blot で使えるものがなかった。また、独自に、特異性等を考慮し、ペプチド抗原、大腸菌で作製した組換えタンパク質を抗原として、独自の兎ポリクローナル抗体の作製を試みたが成功しなかった。一般的に、GPCRタンパク質の強制発現や抗体作製は困難であるとされている。
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| Strategy for Future Research Activity |
GPCR-X遺伝子のｍRNAは誘導がかかるが、タンパク質が産生されていない可能性も否定はできない。そこで、まず、分子量は大きいが目的タンパク質発現の成功率が高いHALOタンパク質をN末端側にタグとして付けたGPCR-Xの発現ベクターを導入し、HEK293細胞に強制発現させて、細胞Lyasteを調整し、HALOタグに対する発光反応でタンパク質の産生を確認する。この陽性コントロールに対して、作製した抗体の反応性を検討して、抗体の性能を評価する。ここで、HALO-tag GPCR-Xを、これらの抗体が認識できていれば、LNCaPでのタンパク質産生は確実に行われてはいない可能性があると判断し、まずは、RNAscopeを用いたISHと臨床検体を用いた臨床病理学的な研究を開始する。並行して、RNAとして機能している可能性、抗体の力価が低く検出感度が足りないためにタンパク質が確認出来ない可能性を校了した抗体の改良・新規作製について検討する。
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