Investigation of pathophysiology and biomarker discovery for prostate cancer in the lipid-deficient hypoxia microenvironment

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11168
• Research Institution: Kanagawa Cancer Center Research Institute
• Principal Investigator: 宮城 洋平 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), 臨床研究所, 所長 (00254194)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小井詰 史朗 地方独立行政法人神奈川県立病院機構神奈川県立がんセンター(臨床研究所), その他部局等, その他 (60416063)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 前立腺がん / 低酸素 / 低栄養 / 診断マーカー / 悪性度 / 進行度

Outline of Annual Research Achievements

申請者らが見出した「がん組織の脂質欠乏低酸素環境」において特異的に発現誘導される分子は，がんの進行度が予測できるマーカーとして，治療対応が必要 な初期進行前立腺がんの診断マーカー／治療分子標的となる可能性がある．本年度は，「脂質欠乏低酸素環境」で発現誘導される遺伝子群から，低酸素ｘ低脂質 で相乗的に10倍以上の発現誘導が起こる7回膜貫通のGタンパク質共役型受容体分子（仮称：GPCR-X）に着目して研究を進めている．GPCR-Xの前立腺がん細胞における機能は未知であるが，診断のみならず，治療の分子標的としても期待できる．
Western Blot や免疫染色ができる抗GPCR-X抗体があれば，研究が飛躍的に進むと判断し，初年度から複数の市販抗体の検定（研究に使える抗体がないと判明），種々の方法での独自の抗体作製を試みていたが，研究に使用可能な抗体を得ることが困難であるとの結論に至った．そこで，まずは，臨床検体を含めたGPCR-Xの発現解析は，タンパク質ではなくin situ hybridizationによるmRNAを対象に進める方針へ転換した．また，GPCR-Xの前立腺がん細胞の性質に与える影響の解析を，CRISPR/Cas9システムによるGPCR-X遺伝子ノックアウト細胞（GPCR-X KO細胞）で行うこととし，アンドロゲン感受性を残しているヒト前立腺がん細胞株であるLNCaP細胞でのGPCR-X KO細胞の作製を完了し，RNAseqによるmRNA発現プロファイルの網羅的解析を進めた．この解析の結果，低酸素ｘ低脂質環境下で，野生型のLNCaP細胞で発現が誘導される遺伝子のうち，GPCR-X KO細胞では誘導されなくなる遺伝子の候補を複数得ることができ，次年度での，GPCR-Xの機能解析の進展が期待できる．

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

理由
低酸素低栄養状態での発現誘導の強度，と，これまでに研究が進んでいない新規性，を考慮してGPCR-Xを標的として研究に着手した．他分野（神経科学）での研究報告があり，抗体も複数市販されているが，Western Blot で使えるものがなかった．また，独自に，特異性等を考慮し，ペプチド抗原，大腸菌で作製した組換えタンパク質を抗原として，独自の兎ポリクローナル抗体の作製を試みたが成功しなかった．一般的に，GPCRタンパク質の強制発現や抗体作製は困難であるとされている．不充分ながら研究過程で得られた複数の抗体を組み合わせて使うことで，特異度を上げて研究に利用する試みも成功しなかったので，発現解析を，タンパク質レベルから，mRNAレベルに切り替えざるを得なかった．

Strategy for Future Research Activity

臨床検体を含めたGPCR-Xの発現解析は，最終産物のタンパク質ではなくin situ hybridizationによるmRNAを対象に進める方針へ転換し，奈川県立がんセンター病理診断部門が保有する前立腺がん針生検標本，前立腺全摘標本で，GPCR-X発現と臨床病理学的因子との関連を解析する．また，アンドロゲン感受性を残しているヒト前立腺がん細胞株であるLNCaP細胞でのGPCR-X KO細胞のRNAseqによる網羅的mRNA発現プロファイル解析の結果から，低酸素ｘ低脂質環境下で，野生型のLNCaP細胞で発現が誘導される遺伝子のうち，GPCR-X OK細胞では誘導されなくなる遺伝子の候補を複数得ているので，これらの遺伝子の機能から，GPCR-Xの機能を推測して研究を進めると共に，特異性が高く，Western blotやELISAなどの検出系で利用可能な，高い性能の抗体等の解析ツールが揃う遺伝子の中から，GPCR-Xのサロゲートマーカー（代用マーカー）となる分子を同定して研究を進める．

Causes of Carryover

抗体を用いたタンパク質レベルで研究を進める可能性を年度末まで模索していたが，最終的に困難と判断した．そこで，次年度，臨床検体を含めたGPCR-Xの発現解析は，最終産物のタンパク質ではなくin situ hybridizationによるmRNAを対象に進める方針へ転換し，その試薬購入費，標本作製費を中心に次年度へと繰り越した．