2017 Fiscal Year Research-status Report

腎臓分化誘導因子が関わる結石形成機序の解明と治療法への応用

Research Project

Project/Area Number	17K11188
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	藤井泰普名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (30566229)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	安井孝周名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40326153) 岡田淳志名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (70444966) 安藤亮介名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), その他 (30381867) 濱本周造名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (80551267) 田口和己名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (00595184) 戸澤啓一名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40264733)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	尿路結石 / シュウ酸カルシウム / lipocalin2
Outline of Annual Research Achievements	研究1（in vivo研究）C57BL/6Ｊマウスを用いた研究（a）結石関連物質の測定：グリオキシル酸投与群では尿中・血清結石関連物質（カルシウム、リン、マグネシウム、クレアチニン）のうち尿中カルシウムの増加を認めた（p<0.05）。（b）結石形成量・形態の評価：Pizzolato染色と偏光顕微鏡により結石形成を確認し、画像解析ソフト（Image pro plus software）をもちいて結石形成量を計測したところ、グリオキシル酸投与群にて腎皮髄境界部を中心に結石形成を認めた（p<0.05）。（c）lipocalin2、MAPK経路、サイトカイン評価：摘出腎よりcDNA,タンパクを抽出した。今後、lipocalin2、MAPK経路（braf、MEK、ERK、E-cadherin）、サイトカイン（TGFβ等）の各遺伝子・蛋白発現を定量PCR、免疫組織染色、western blottingにて評価する。（in vitro研究）（d）シュウ酸カルシウム結晶の尿細管細胞への付着能（Crystal-cell-interaction）の評価：14Cでラベルしたシュウ酸カルシウム結晶を作成し、これを腎尿細管細胞へ添加する。 30分後、細胞に付着していないシュウ酸カルシウム結晶をよく洗浄し除去した上で、シンチレーションバイアル内に挿入してから液体シンチレーションカウンターで14Cを測定した。今後、尿細管細胞へ付着しているシュウ酸Caを測定する。（e）lipocalin2、MAPK経路、サイトカイン評価：抽出した腎尿細管細胞を回収した。今後、lipocalin2、MAPK経路（braf、MEK、ERK、E-cadherin）、サイトカイン（TGFβ等）を蛍光免疫染色し、画像的評価を行う。さらに、定量PCR、ELISA、western botting法を用いて定量化し比較する。研究2 lipocalin2による腎結石治療法の開発:研究1の結果を確認後、行う予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason おおむね研究計画通りに進んでいる。 lipocalin2のマウスへの尾静脈注射の処置の確立をおこなっている。
Strategy for Future Research Activity	【研究1】腎結石形成におけるlipocalin2の作用機序の解明（in vivo）C57BL/6Ｊマウスを用いた研究：（c）lipocalin2、MAPK経路、サイトカイン評価摘出腎においてlipocalin2、MAPK経路（braf、MEK、ERK、E-cadherin）、サイトカイン（TGFβ等）の各遺伝子・蛋白発現を定量PCR、免疫組織染色、western blottingにて評価する。（in vitro）マウス腎尿細管細胞（M-1）を用いた研究（d）シュウ酸カルシウム結晶の尿細管細胞への付着能（Crystal-cell-interaction）の評価：尿細管細胞へ付着しているシュウ酸カルシウム結晶を定量的に評価する。（e）lipocalin2、MAPK経路、サイトカイン評価：lipocalin2、MAPK経路（braf、MEK、ERK、E-cadherin）、サイトカイン（TGFβ等）を蛍光免疫染色し、画像的評価を行う。さらに、定量PCR、ELISA、western botting法を用いて定量化し比較する。【研究2】lipocalin2による腎結石治療法の開発；研究１と同様にin vivoとin vitroで計画する。
Causes of Carryover	本研究の核となる腎結石形成の因子解析に関する試薬が適切でないことが判明し、適切な試薬選定をし直した。そのため研究計画が遅れ次年度使用額が生じた。H30年度では腎結石形成機序に関わると考えられる腎臓分か誘導因子を定量PCR,western blottingにて評価していきたい。