2018 Fiscal Year Research-status Report
セルトリ細胞の分化・成熟メカニズムの包括的解明と生殖医療への新展開
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17K11204
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
林 祐太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40238134)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安井 孝周 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (40326153)
水野 健太郎 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (70448710)
守時 良演 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (50595395)
西尾 英紀 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (10621063)
加藤 大貴 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 臨床研究医 (00620931)
梅本 幸裕 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (80381812)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | セルトリ細胞 / 細胞分化 / インヒビンB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
精巣の機能不全は男性不妊症や内・外性器の発育障害をきたし、少子化が進むわが国において取り組むべき重要疾患である。私たちは、精巣発生や精子形成メカニズムの研究を通じて精巣組織における「セルトリ細胞」の重要性に注目している。セルトリ細胞は、胎児期には内分泌細胞、成熟期には精子形成の支持細胞と、発生・発達の時期によって異なる機能を有する。こうしたセルトリ細胞の分化・成熟メカニズムは明らかにされておらず、疾患との関連性も明らかでない。そこで本研究では、セルトリ細胞の分化・成熟にかかわる分子生物学的基盤を明らかにすることを目的として実験計画を立案した。
平成30年度では、セルトリ細胞の成熟に関与する遺伝子の選別と、その機能解析を計画していたが、前年度に引き続きセルトリ細胞の分離方法にとりくむとともに、組織学的な検討も平行して行った。実験動物の精巣組織からセルトリ細胞の初代培養を行ったが、幼若期の精巣とともに、思春期・成熟期の精巣からの分離実験も行った。しかしながら細胞の回収率が低く、原因として成熟に伴う精巣組織内の細胞数の増加が考えられた。そこで、組織学的にセルトリ細胞の成熟を光学顕微鏡・電子顕微鏡などを用いて経時的な観察を行った。造精機能障害モデルとして、妊娠中に抗アンドロゲン剤であるflutamideを投与したモデルを作成した。モデル動物の精巣組織を組織学的に観察したところ、成熟にしたがって、セルトリ細胞間に存在する血液精巣関門の関連タンパク質の変化が同定することに成功した。関連タンパク質の免疫染色、western blotting、定量RT-PCRなどで定量的に評価を行った。また、臨床検体を用いて、セルトリ細胞から分泌されるインヒビンBの血中濃度と精巣組織との関連についても検討しており、正常にくらべて停留精巣症例ではインヒビンB値がより低いことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の研究計画では、前年度までにセルトリ細胞で発現するAR、AMH遺伝子座にGFPをノックインした遺伝子組み換え細胞を、CRISPR/Cas9系を用いて作成することを予定していた。さらに、遺伝子組み換え動物の作成も行い、この動物精巣におけるセルトリ細胞の成熟ステップを可視化するとともに、大きく成熟度が変化する時期のセルトリ細胞で発現変化する遺伝子群をマイクロアレイで検討することを予定していた。しかしながら、前年度の時点で、幼若精巣組織から細胞分離に一部成功したものの、遺伝子組み換え細胞の作成には至っていない。平成30年度の計画では、これらの細胞で発現変化を認める遺伝子群を同定し機能解析することを予定していたが、取り掛かれていない。また、成熟度の異なる精巣組織からの細胞分離を試みたが、細胞の回収率が低く、原因として成熟に伴う精巣組織内の細胞数の増加が考えられた。他の研究手法を用いて進捗させるため、組織学的な観察研究も取り入れており、一定の成果を得ることができた。さらに、臨床検体を用いた研究も平行して進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞分離の方法を工夫するなど、今年度も精巣組織から細胞分離実験は行っていく。また、フローサイトメーターを用いてセルトリ細胞に特異的発現するSOX9やWT1などのタンパク質を認識する特異抗体を利用した選別法も試みたい。また、細胞を分離するのではなく精巣の小塊で培養する、器官培養系による方法を行うことも検討したい。また同時に、株化されたセルトリ細胞（TM4）を用いて、遺伝子導入実験や、CRISPR/Cas9によるノックインセルトリ細胞の樹立を行い、導入効率などの予備実験を進めておきたい。さらに、組織学的検討から得られたセルトリ細胞間の血液精巣関門の関連タンパク質と、細胞成熟との関連についても、さらに詳細な検討を進めていきたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
年度末までの計画が早期に終了し、また次のステップの研究にかかる試薬の挿入が年度を超えたので、次年度使用額が生じた。引き続き計画に沿って、セルトリ細胞の分化・成熟メカニズムの包括的解明と生殖医療への新展開を見据えた研究を行っていく。
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