2018 Fiscal Year Research-status Report

ミトコンドリアの適合性の機構解析と治療法開発に関する基盤研究

Research Project

Project/Area Number	17K11248
Research Institution	Jichi Medical University
Principal Investigator	遠藤仁司自治医科大学, 医学部, 教授 (50221817)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ミトコンドリア / 遺伝子治療 / ミトコンドリア遺伝子異常 / ヘテロプラスミー / ゲノム編集 / TALEN / 核ーミトコンドリア適合性
Outline of Annual Research Achievements	ミトコンドリアDNA(mtDNA)は正常の個体についても個々に多型が存在する。近年、生殖医療においてミトコンドリア遺伝子異常症の受精卵に対して前核置換法を用いた遺伝子治療法が実施されており、その過程で第三者のミトコンドリアとほぼ置換されること、一部では二者のmtDNAが混在するヘテロプラスミーの状態であることが報告されている。電子伝達系を構成する複合体はmtDNA由来のタンパク質と核由来のタンパク質から構成されているが、mtDNAと核遺伝子との適合性に関する研究は極めて少ない。そこで、本研究では①同一核型に亜種mtDNAを置換したコンプラスティックマウス(conplastic mouse)の独自作製によって表現形が変化するマウスモデルを確立すること、②これらのコンプラスティックマウスから前核置換法を用いてmtDNAが混在するヘテロプラスミーのES細胞を樹立すること、③TALEN等のヌクレアーゼのミトコンドリア標的への最適化を試み、特定のmtDNAを除去する治療基盤を確立することを目的としている。本年度までは①ミトコンドリアと核の適合性が糖尿病の症状の増悪に関することを示し、核－ミトコンドリアの不適合性が、病態に影響を与えることを初めて明らかにした。②B6マウスと亜種マウスミトコンドリアのヘテロプラスミーのES細胞を作製した。ミトコンドリアを標的する複数のミトコンドリアタンパク質を連結したTALEN改変ベクターを作製して、ミトコンドリア遺伝子治療の基盤実験を行なったところ、一方のmtDNAを特異的に切断し除去するゲノム編集の効果が認められた。特異性や除去効率などを詳細な検討など、来年度はより詳細な検討を加え、論文化を実施する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成２９年度は、疾患モデルでのミトコンドリア適合性を検討するために、核型が糖尿病モデルマウスKK-Ayを用いてミトコンドリアが亜種SHHマウス由来であるコンプラスティックマウスを作製し、表現形解析を実施した。KK-Ayを核型としてミトコンドリアをSHHに置換したKK-Ay mtSHHマウスにおいて、通常のKK-Ayマウスに比べ、体重の減少、空腹時血糖の上昇、インスリン抵抗性の上昇を明らかにした。酸素消費モニターでは脂肪燃焼の増加が示された。肝臓のmtDNA量の定量PCRでは有意な差を認めた。単離肝臓ミトコンドリアを用いたフラックスアナライザーによる解析では、KK-Ay mtSHHにおいて電子伝達系の複合体IIの活性の亢進が確認された。以上より、亜種マウスとのミトコンドリアの置換により糖尿病の症状の増悪が認められ、核－ミトコンドリアの不適合性により、病態に影響を与えることを初めて明らかにした。今後さらに詳細な検討を行う予定である。平成３０年度は、前核置換法を用いてB6マウスおよびB6mtSHHの受精卵から２つのmtDNAが混在するヘテロプラスミーのES細胞を樹立することにより、ゲノム編集を用いた遺伝子治療へのモデル細胞を開発・作製した。さらに、ミトコンドリア移行シグナルを連結したB6とSHH由来のmtDNAを別々に認識して切断するTALENベクターを作製した。また、ミトコンドリアDNA結合タンパク質をTALENに連結した改変ベクターも作製した。これらのベクターをヘテロプラスミーES細胞に導入したところ、一方のmtDNAを特異的に切断するゲノム編集の効果が認められた。特異性や除去効率などを詳細な検討を行なっており、mtDNA遺伝子治療の基礎データとする予定である。
Strategy for Future Research Activity	平成３１年（令和元年）度は、主に前年度までの未達部分と、達成によって新たに生じた問題に対応する。まず、KK-Ayを核型としてミトコンドリアをSHHに置換したコンプラスティックマウスKK-Ay mtSHHの糖尿病の増悪が認められる病態の詳細な解析を行う予定である。肝臓における糖新生に関与する遺伝子の発現解析、糖新生に関与する各種ホルモン（アドレナリン、コルチゾール、グルカゴン）の検討、肝臓初代培養細胞でのグルカゴン反応性の検討などを実施する。さらに肝臓ミトコンドリアの電子伝達系における酵素活性や複合体解析などを実施する。また、KK-AyのmtDNAの全塩基配列を同定し、SHH由来mtDNAの塩基配列の置換の比較検討を行う。以上から、核―ミトコンドリア適合性が疾患の増悪に関与する詳細な機構を明らかにし、報告する予定である。また、ミトコンドリア遺伝子治療ベクターの改変においては、ミトコンドリア移行シグナル部分を、ミトコンドリアDNA結合因子であるTFAMやmSSBに改変したベクターとの詳細な検討が必要である。ゲノム編集を用いたミトコンドリア遺伝子治療の一般的な問題点の一つには、非特異的な塩基認識によるmtDNAの非特異的除去があり、胚の発生初期においてmtDNA量が減少すると適切な胚発生過程が得られないとの報告がある。本研究において、ヘテロプラスミーのES細胞への遺伝子治療の結果、全体的なmtDNA量が減少するか否かについて、詳細に検討する予定である。これらを明らかにすることによって、論文を作成する予定である。