2017 Fiscal Year Research-status Report
癌特異的プロモーターと磁性ナノ粒子を応用した婦人科癌における末梢血中腫瘍細胞解析
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17K11270
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
高倉 正博 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (20313661)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前之園 信也 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (00323535)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 末梢血中腫瘍細胞 / テロメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
末梢血中腫瘍細胞（circulating tumor cells: CTC）は癌の新規バイオマーカーとして、またliquid biopsyの手段として注目を集めているが、その検出方法や応用法はいまだに発展途上である。現在主流の細胞膜表面抗原に頼った検出方法では様々に姿を変える癌細胞を捉えきれていないのが現状である。我々は癌の不死化能に着目し、不死化関連酵素であるテロメラーゼの活性化を指標として癌細胞を捕捉分離するシステムの構築に携わってきた。これまではGFP発現テロメラーゼ依存的増殖型アデノウイルスを血液検体に感染させることでCTCを検出していた。本研究ではウイルス非依存的な検出システムを構築し、さらに磁性ナノ粒子を応用して従来は不可能であった生細胞の回収・解析を可能とする方法の確立を第一の目的としている。またCTCのマウスモデルを作成し癌転移に関わる因子を解明することを第二の目的としている。
ウイルス非依存的CTC検出システム構築のためにhTERTプロモーター下流にβ-integrin膜貫通ドメインと人工タグタンパク質であるHalotagの融合タンパクを発現するようにデザインしたプラスミドを作成し、癌培養細胞にエレクトロポレーション法で導入した。これによってhTERTプロモーターが活性化されている細胞では細胞膜上にタグ蛋白が発現される（Surface Tag-protein expressed in tumor cells: STET）。またhTERT転写活性がない癌に対応するためにやはり癌特異的に高い転写活性を示すプロモーターとしてsurvivinプロモーターをSTET上流に配したsurvivin-STETを作成し、両者の併用を試みた。培養細胞においてSTETならびにsurvivin-STETは高い陽性率を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. hTERTプロモーター下流にβ-integrin膜貫通ドメインと人工タグタンパク質であるHalotagの融合タンパクを発現するようにデザインしたプラスミドを作成した。これを細胞に導入するとhTERTプロモーターが活性化されている細胞では細胞膜上にタグ蛋白が発現される（Surface Tag-protein expressed in tumor cells: STET）。このタグ蛋白Halotagの特異的リガンドと蛍光物質の結合体を用いると細胞を蛍光標識でき、また磁性体-リガンド結合体を用いることで細胞回収が可能となる。
2. STETベクターの導入方法の検討
安価かつ細胞毒性の少ない導入方法として、マルチパルス式エレクトロポレーション法を採用した。本法による癌培養細胞におけるSTETの導入効率（Halotagリガンド-GFPによる蛍光標識での陽性率）は80～95％、細胞の生存率は75～100%であり、十分実用に耐えうるものと考えられた。
3. テロメラーゼ陰性細胞への対応
hTERT転写活性がない癌に対応するためにやはり癌特異的に高い転写活性を示すプロモーターとしてsurvivinプロモーターをSTET上流に配したsurvivin-STETを作成し、STETと同様の実験を行った。survivin-STETによる陽性率は70～85%とSTETよりやや低かったが、両者を併用することで5%程度の陽性率の上積みが可能であることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 血液を用いたコントロール実験 次年度中に開発・検討したSTETベクターのマルチパルス式エレクトロポレーション法による導入を、血液に癌細胞を少数混ぜ込んだCTCモデルサンプルを用いて癌細胞の検出率、生存率を検討する。今年度までの実験と同様にHalotagリガンド-GFPによる蛍光標識と同時に独自に作成したHalotagリガンド-ナノ磁性体を用いたCTC回収も試みる。
2. 臨床検体での検討 CTCモデルサンプルを用いたコントロール実験で良好な検出感度が得られた場合は、さらに臨床検体でのCTC検出ならびに回収を試みる。我々の過去の検討ではCTCの多くは上皮マーカーの発現を欠いていた。これが癌の浸潤転移に関与している可能性を踏まえて、上皮間葉転換（EMT）に関わる因子の発現、原発巣に追加して起こる変異の有無などを解析することを目標とする。
3. CTCモデルマウスの作成 臨床検体で得られたCTCにおける遺伝子発現のデータと癌の浸潤転移の関連を調べるためには動物実験モデルが重要となる。免疫不全マウスでは癌の血管内移行が容易に起こることが知られており、この目的には適していない。正常免疫マウスの胎生期にヒト癌細胞を接種することでヒト細胞に対する免疫寛容を惹起し、出生後、ヒト癌細胞接種モデルを作成する系が近年報告された。我々はこれを応用してマウス血中のCTCを回収検討する系を作成することを目指す。
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| Causes of Carryover |
理由：本年度はCTC検出法開発のためのベクター作成とin vitro実験が主体であり、試薬・消耗品の使用も少なく経費がかからなかった。
使用計画：CTCモデルサンプルでの条件設定に入ると試薬の使用量なども増加するため相応の経費が必要になるものと推察される。臨床検体での検討に関しても同様である。また次世代シーケンサーが本学遺伝診療部において稼働したので、CTC検体における遺伝子異常の網羅的検討も考慮する。
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