2019 Fiscal Year Research-status Report
癌特異的プロモーターと磁性ナノ粒子を応用した婦人科癌における末梢血中腫瘍細胞解析
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17K11270
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| Research Institution | Kanazawa Medical University |
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Principal Investigator |
高倉 正博 金沢医科大学, 医学部, 准教授 (20313661)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
前之園 信也 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (00323535)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 末梢血中腫瘍細胞 / テロメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
末梢血中腫瘍細胞（circulating tumor cells: CTC）は癌の新規バイオマーカーとして、またliquid biopsyの手段として注目を集めているが、その検出方法や応用法はいまだに発展途上である。現在主流の細胞膜表面抗原に頼った検出方法では様々に姿を変える癌細胞を捉えきれていないのが現状である。我々は癌の不死化能に着目し、不死化関連酵素であるテロメラーゼの活性化を指標として癌細胞を捕捉分離するシステムの構築に携わってきた。これまではGFP発現テロメラーゼ依存的増殖型アデノウイルスを血液検体に感染させることでCTCを検出していた。本研究ではウイルス非依存的な検出システムを構築し、さらに磁性ナノ粒子を応用して従来は不可能であった生細胞の回収・解析を可能とする方法の確立を研究の目的としている。
ウイルス非依存的CTC検出システム構築のためにhTERTプロモーター下流にβ-integrin膜貫通ドメインと人工タグタンパク質であるHalotagの融合タンパクを発現するようにデザインしたプラスミドを作成し、対象細胞にエレクトロポレーション法で導入した。これによってhTERTプロモーターが活性化されている細胞では細胞膜上にタグ蛋白が発現される（Surface Tag-protein expressed in tumor cells: STET）。正常血液に培養癌細胞を一定数混入させたCTCモデル検体において、癌細胞検出実験を行った。癌検出感度は当初、約50%であった。実用にはやや低い検出率であると考えられたため、がん特異的プロモーターとして知られているSurvivinプロモーターを組み込んだSTETを作成し併用することで約10%の検出力の増加を得た。現在さらに有核白血球分画の分離方法、検出方法、導入方法の改善を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1. STETベクターの構築と導入方法の検討
hTERTプロモーター下流にβ-integrin膜貫通ドメインと人工タグタンパク質であるHalotagの融合タンパクを発現するようにデザインしたプラスミドを作成した。これを細胞に導入するとhTERTプロモーターが活性化されている細胞では細胞膜上にタグ蛋白が発現される（Surface Tag-protein expressed in tumor cells: STET）。このタグ蛋白Halotagの特異的リガンドと蛍光物質の結合体を用いると細胞を蛍光標識でき、また磁性体-リガンド結合体を用いることで細胞回収が可能となる。STETの導入方法は安価かつ細胞毒性の少ないマルチパルス式エレクトロポレーション法を採用した。本法による癌培養細胞におけるSTETの導入効率（Halotagリガンド-GFPによる蛍光標識での陽性率）は80～95％、細胞の生存率は75～100%であり、十分実用に耐えうるものと考えられた。
2. 正常血液を用いたコントロール実験
昨年度までに開発・検討したSTETベクターのマルチパルス式エレクトロポレーション法による導入を、正常血液に培養癌細胞を一定数混入させたCTCモデル検体において、癌細胞検出実験を行った。STET発現細胞は蛍光標識リガンドを用いてFACSによる検出と回収を試みた。混入させた癌細胞の検出感度は約50%であった。実用にはやや低い検出率であったため、hTERTプロモーターと同様にがん特異的プロモーターとして知られているSurvivinプロモーターを組み込んだSTET（Survivin STET）を作成し従来のhTERT STSETと併用することで約10%の検出力の増加を得た。しかしながら、実際の血液検体で検査を行うにはさらなる検出力の向上が必要と考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. コントロール実験：Telomerase STETとSurvivin STETの併用により検出感度は約60％となったが依然として実用にはやや低いため、さらなる改良を施す予定である。具体的には以下の通りである。①CTCを含む血球分画の分離方法の改善：②検出方法の改良：従来は標識蛍光物質としてGFPを用いていたが、より高輝度の蛍光物質への変更を試みる。またナノ粒子磁性体とHalotagの特異的リガンドの結合体による回収を試みる予定である。
2. 臨床検体での検討：CTCモデルサンプルを用いたコントロール実験で良好な検出感度が得られた場合は、さらに臨床検体でのCTC検出ならびに回収を試みる。我々の過去の検討ではCTCの多くは上皮マーカーの発現を欠いていた。これが癌の浸潤転移に関与している可能性を踏まえて、上皮間葉転換（EMT）に関わる因子の発現、原発巣に追加して起こる変異の有無などを解析することを目標とする。
3. CTCモデルマウスの作成 臨床検体で得られたCTCにおける遺伝子発現のデータと癌の浸潤転移の関連を調べるためには動物実験モデルが重要となる。免疫不全マウスでは癌の血管内移行が容易に起こることが知られており、この目的には適していない。正常免疫マウスの胎生期にヒト癌細胞を接種することでヒト細胞に対する免疫寛容を惹起し、出生後、ヒト癌細胞接種モデルを作成する系が近年報告された。我々はこれを応用してマウス血中のCTCを回収検討する系を作成することを目指す。
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| Causes of Carryover |
理由：本年度はCTC検出法確立のためのin vitro実験が主体であり、試薬・消耗品の使用も少なく経費がかからなかった。
使用計画：CTCモデルサンプルでの条件設定のいため試薬の使用量なども増加するため相応の経費が必要になるものと推察される。また臨床検体での検討に関しても同様に多量のプラスミド生成などの必要が生じるため試薬の購入費用が必要である。また論文作成のための英文校正料、投稿料も必要になると考えられる。
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