2019 Fiscal Year Research-status Report

フラビン蛋白蛍光イメージングを用いたマウス大脳皮質前庭領野同定とその可塑性の解析

Research Project

Project/Area Number	17K11319
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	大島伸介新潟大学, 医歯学系, 助教 (70632438)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	前庭領野 / マウス / フラビン蛋白蛍光イメ―ジング
Outline of Annual Research Achievements	前庭系においてはヒトやサルでは島後方のPIVC（Parieto Insular Vestibular Cortex）が前庭領野にあたるが、マウスなどの小型動物では同定されていない。PIVCの機能を解明するために、フラビン蛋白蛍光イメージングを用いてマウスの前庭領野を同定することが本研究の目的である。まず、マウスに対して適切な前庭刺激を探ることから開始した。5-8週のC57BL/6マウスを用いて、カロリック冷、温刺激によるそれぞれ前庭機能低下、亢進刺激を与えたが、平衡障害を示す眼振所見の再現性は高くなかった。次いで、経外耳道的に鼓室内に電気刺激を与えるガルバニック刺激を試みた。導電気刺激装置からアイソレーターを介してbiphasic刺激を出力し、針電極針を前庭窓へ留置して刺激する方法である。他の動物種で実績ある刺激法だがマウスに行った報告はない。体性感覚刺激を避けるために電極先端以外の部分は絶縁し、前庭層より浅い部分の組織を可及的に除去する術式に変更したところ、刺激周波数に応じて大脳の反応領域が変化する所見を得た。すなわち、低周波数刺激ではPIVCと思われる前庭感覚野、より高周波刺激では聴覚野が反応する所見が得られ、再現性を確認中である。さらに遺伝子改変マウスの導入を開始した。GCaMP6は、GFPを用いた蛍光カルシウムプローブタンパク質GCaMPの改変体である。本マウスはThy1プロモーター下でGCaMP6を発現するコンストラクトがトランスジーンされており、In vivoにおける神経活動の可視化が可能であると考える。GCaMP6ではフラビン蛋白蛍光の数倍の強度でイメージングが可能と報告されており、PIVCの同定に極めて有用であると期待している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason まず前庭刺激として確実に前庭機能低下、または亢進させなければ本研究を進めていくことは困難である。ガルバニック刺激による前庭領野反応の再現性を高める手術手技、適正刺激を見出す段階にとどまっている。また、実験室の耐震補強工事が2019年8月から行われており、実験室の代替がなく、動物実験を行うことができなかったため。
Strategy for Future Research Activity	まず、ガルバニック刺激による前庭領野PIVC領域の反応の再現性を高め、マウス大脳皮質の前庭領野を同定する。電気刺激であるガルバニック刺激でPIVC領域を同定後、平衡覚の自然刺激、カロリック刺激でも確認する。われわれがマウスを実験動物に使用する理由は、遺伝子改変マウスを使用できることにあり、イメージングはC57BL/6のフラビン蛋白蛍光の酸化還元反応のみならず、GCaMPマウスでも確認する予定である。すでにヘテロ個体を購入し、導入の準備を進めている。まだ再現性が乏しいものの、ガルバニック刺激の刺激周波数によって、前庭領野のみならず聴覚野も反応を示すことを示唆するデータが得られており、前庭領野と聴覚野の相互関係を解明したい。例えば聴覚刺激によるPIVC領域の可塑性が示されれば、聴覚刺激を用いた新たな平衡リハビリテーションの可能性を追求できると考えている。また我々のイメージングシステムは両側同時に測定可能な点が独創的であり、このメリットを生かしてPIVC領域、聴覚野の左右差を比較することで、平衡覚におけるPIVCのメカニズムを同時に解明していきたいと考えている。
Causes of Carryover	（理由）現在は予備実験的な先行実験を反復しデータの再現性を高める事、また本研究において重要な前庭刺激方法やその刺激パラメータの再現性を高めている段階である。今後は本研究のテーマであるマウス前庭領野の同定、さらにその可塑性を解析する予定であり、さらに研究の継続が必要である。（使用計画）実験用マウス、麻酔薬などの薬剤、固定器具などの消耗品等に使用する。また研究成果発表や情報収集のための学会参加時の旅費などにも使用する予定である。