2017 Fiscal Year Research-status Report
自然免疫応答を介した蝸牛内炎症の難聴発症における役割および病態の解明
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17K11324
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
中西 啓 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (20444359)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 免疫応答 / 蝸牛 / 難聴 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は非症候群性遺伝性難聴家系（DFNA34）の連鎖解析を行い、本家系の難聴がNLRP3遺伝子変異により生じていることを明らかにした。現在までに、NLRP3は全身性自己炎症性疾患であるクリオピリン関連周期熱症候群（CAPS）の原因遺伝子であることが知られている。CAPS患者では、NLRP3の機能獲得型変異により自然免疫担当細胞から恒常的にInterleukin-1β（IL-1β）が分泌されるために全身性炎症が生じると考えられている。DFNA34患者では難聴以外に臨床症状が認められないため、機能獲得型変異により全身性炎症が生じ、その一部症状として蝸牛内炎症が生じたとは考えにくい。そこで我々は、蝸牛内に組織マクロファージが存在し、その細胞からIL-1βが分泌されたために蝸牛内炎症が惹起され非症候群性難聴が生じたという仮説を立てた。本研究では、この仮説を、マウスを用いて証明するとともに、蝸牛内炎症がヒトの難聴疾患と関連しているかについて検討することが目的である。
これまでに、野生型マウスを用いて、組織マクロファージでNLRP3インフラマソームが活性化されること、蝸牛内においてIL-1βの下流の炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α）が上昇することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、野生型マウスを用いて、組織マクロファージでNLRP3インフラマソームが活性化されること、蝸牛内においてIL-1βの下流の炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α）が上昇することを明らかにした。それぞれについて、詳細を以下に記載する。
①組織マクロファージでNLRP3インフラマソームが活性化されることについて
NLRP3インフラマソームは、細菌やウィルスなどの病原体により活性化され、IL-1βの分泌を惹起することにより炎症反応を引き起こす。NLRP3インフラマソームの活性化は厳重にコントロールされており、活性化には2段階のステップを誘導することが必要である。この2段階のステップによりIL-1βが分泌される現象は、NLRP3インフラマソームに特異的であるため、目的とする細胞内でNLRP3インフラマソームが活性化されるか評価するために応用されている。本研究では、野生型マウスより蝸牛組織を分離・培養し、最初のステップを誘導するためにリポ多糖（LPS）を加えて6～24時間培養し、さらに次のステップを誘導するためにATPを加えて1時間培養して、培養液中のIL-1βの濃度を測定した（LPS+ATP）。その結果、LPS+ATPを加えた群では、何も加えなかった群やLPSのみ加えた群と比較して、有意に培養液中のIL-1β濃度が高かった。
②蝸牛内においてIL-1βの下流の炎症性サイトカイン（IL-6、TNF-α）が上昇することについて
野生型マウスより蝸牛を摘出し、LPS+ATPの条件下で培養して、培養液中のIL-1β、IL-6、TNF-α濃度をELISA法により測定した。その結果、LPS+ATPを加えた群では、何も加えなかった群やLPSのみ加えた群と比較して、有意に培養液中のIL-1β、IL-6、TNF-α濃度が高かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
蝸牛内炎症により難聴が生じるか評価するために、DFNA34家系で同定された変異を用いて新たにNLRP3モデルマウスを作製する。ノックインマウスの作成は、CRISPR/Cas9法によるゲノム編集技術を用いて行う。CRISPR/Cas9法を用いたノックインマウスの作成は、数社が受託しており、本研究でも作製を依頼する予定である。オフターゲット作用により本来期待していない部位に変異が生じる可能性があるので、野生型マウスと数世代交配してオフターゲット変異を持たないマウスを選別する。作製したNLRP3ノックインマウスにおいて、体重、皮疹、生存期間を観察するとともに、全血球計算や血液中のサイトカイン濃度を測定する。また、聴覚機能についても評価する。それぞれについて、詳細を以下に記載する。
①体重、皮疹、生存期間の観察、全血球計算や血液中のサイトカイン濃度の測定について
作製したNLRP3ノックインマウスにおける全身性炎症や成長障害を評価するために、体重、皮疹、生存期間を観察し、野生型マウスと比較する。なお、皮疹の評価は、視診および皮膚組織切片を観察して評価する。また、全身性炎症が惹起されているか、惹起されているとしたらどの程度の炎症がいつ頃から惹起されているのか評価するために、全血球計算や血液中のサイトカイン濃度を測定する。全血球計算では、赤血球数、白血球数、白血球分画、血小板数を自動血球計算装置により測定する。また血液中のサイトカインに関しては、IL-1β、IL-6、TNF-α濃度をELISA 法により測定する。
②聴覚機能の評価について
聴力障害の有無について評価するために、マウスの聴力をABRおよびDPOAEを用いて測定する。
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| Causes of Carryover |
NLRP3ノックインマウス作製費用の支払いが、H30年度以降になったため次年度使用額が生じた。H30年度中に、NLRP3ノックインマウス作製費用として、次年度使用額を利用する予定である。
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[Journal Article] NLRP3 mutation and cochlear autoinflammation cause syndromic and nonsyndromic hearing loss DFNA34 responsive to anakinra therapy.2017
Author(s)
Nakanishi H, Kawashima Y, Kurima K, Chae JJ, Ross AM, Pinto-Patarroyo G, Patel SK, Muskett JA, Ratay JS, Chattaraj P, Park YH, Grevich S, Brewer CC, Hoa M, Kim HJ, Butman JA, Broderick L, Hoffman HM, Aksentijevich I, Kastner DL, Goldbach- Mansky R, Griffith AJ.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A
Volume: 114
Pages: E7766-E7775
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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