2018 Fiscal Year Research-status Report
ion transport and its regulation in the inner ear (endolymphatic sac, stria vascularis)
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17K11330
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
宮下 武憲 香川大学, 医学部, 准教授 (60363214)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 内耳 / イオン輸送 / イメージング / 内リンパ嚢 / mRNA / LCM / ホルモン / メニエール病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
内リンパの産生・吸収の調節は内耳機能維持にはきわめて重要である。この内リンパ液は、蝸牛の血管条で産生され、内リンパ嚢で吸収されると考えられている。内リンパ液が過剰になると、難聴やめまいが生じるため、聴力と平衡感覚の維持には内リンパ液の調節が重要である。すでに、我々は、内リンパ嚢においてイオン輸送が内リンパの吸収に重要な働きをしていることを示唆する研究結果を蓄積している。この内リンパの輸送能を制御することができれば、内リンパ水腫を呈するメニエール病などの根本的な治療が可能である。
これまでにも、分子生物学的アプローチとして、laser capture microdissection法を用いてラット内リンパ嚢上皮細胞からｍRNAを抽出し、存在が推定されるイオン輸送体、および、その制御因子の発現を調べ、発現していれば免疫染色で内リンパ嚢での局在を調べている。そこで、微量ｍRNAの新しい抽出法を応用し、内リンパ嚢上皮細胞からのmRNAのリアルタイムPCRによる定量化に成功した。そのため、イオン輸送体の制御について研究が進められるようになった。イオン輸送体のmRNA発現を増やすと想定される条件でのイオン輸送体mRNAを定量比較することで、イオン輸送体の制御について研究を進めている。まず、第一候補であるアルドステロンの内リンパ嚢上皮細胞におけるイオン輸送の制御機構について、研究を進めている。今後、より安定化した定量を目指して、さらに研究を進める予定である。
また、共焦点レーザー顕微鏡システムに加え、実態顕微鏡を使用した新たなイメージングシステムを構築している。これまでは不可能であった深部までイメージ可能となり、また、より広い領域を評価することが可能になった。今後、この新たなイメージングシステムも用いて、さらにイメージングを進めていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本プロジェクトでターゲットの一つとしている内リンパ嚢への薬物投与経路として、経静脈的に投与する全身投与（内リンパ嚢上皮細胞からみるとbasal sideからの投与）、に加え、系内リンパ経由で薬物を投与するマウスの実験系を開発した。半規管経由で薬物を投与することで、apical sideからの薬物投与が可能となり、内リンパに接する細胞や、内リンパのイメージング実験が可能になった。この技術を用いて、内リンパ腔に面する細胞のイメージングに挑戦している。現在より深部のイメージングにより、さらに多くの情報が得られることがわかり、新たに実態顕微鏡を用いたイメージングシステムを構築している。試作モデルを用いたイメージングでは、蛍光イメージングが可能であることが確認できた。さらに、このシステムを改善し、イメージングを進める予定である。
分子生物学的アプローチとして、これまでもlaser capture microdissection法を用いてラット内リンパ嚢上皮細胞からｍRNAを抽出し、存在が推定されるイオン輸送体、および、その制御因子の発現を調べ、発現していれば免疫染色で内リンパ嚢での局在を調べてきた。さらに、微量ｍRNA抽出法を応用し、内リンパ嚢上皮細胞からのmRNAのリアルタイムPCRによる定量化に成功した。さらに、収率が不安定であったため各ステップを詳細に見直し検討し、実験中のみならず保存や搬送時の条件を細かく再設定することで安定した収率を得られるようになり、2種のモデルラットを使用し、内リンパ嚢上皮細胞からのmRNA抽出をlaser capture microdissection法を用いて成功し、リアルタイムPCRで定量することにも成功した。今後、条件を変えながらさらに定量実験を重ね、内リンパ嚢におけるイオン輸送およびその制御系について解析を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、新たに開発中のイメージングシステムも用いることで、これまでの共焦点レーザー顕微鏡を用いたイメージングで十分できなかった、より広い領域、より深い領域でのイメージングを目指している。解像度が高く立体的に解析できる共焦点レーザー顕微鏡システムのイメージングシステムの利点と、広く深い領域をイメージングできる新しいシステムの利点をそれぞれ生かして、内リンパのイオン輸送及びその制御因子について解析を進めていく予定である。具体的には、イオン輸送の制御因子として、イオン輸送体の調節因子（インヒビター、アゴニスト等）を投与したときの内リンパ嚢上皮細胞内および血管条辺縁細胞内のイオン動態をリアルタイムで計測することで、制御因子の確定およびその制御因子の制御能を直接測定することをめざして実験を進めている。
また、分子生物学的アプローチとして、laser capture microdissection(LCM)法を用いてラット内リンパ嚢上皮細胞からｍRNAを抽出し、存在が推定されるイオン輸送体、および、その制御因子の発現を調べ、発現していれば免疫染色で内リンパ嚢での局在を調べる予定である。さらに、イオン輸送体のアップレギュレーション、ダウンレギュレーションに関与すると想定される条件でのイオン輸送体mRNAを定量比較することでイオン輸送体の制御について研究を進めていく予定である。
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Research Products
(2 results)
