Tlx3によるES細胞から内耳前駆細胞への分化誘導法の確立と内耳再生医療への応用

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11344
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 秦 龍二 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (90258153)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾身 実 藤田保健衛生大学, 医学部, 助教 (00400416) ; 内藤 健晴 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (10172248) ; 吉岡 哲志 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (20648539)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 再生医療 / 内耳再生 / Tlx3 / Ngn1 / Ngn2

Outline of Annual Research Achievements

Tlx3はマウスでは発生の初期(E9)に内耳神経節（cochleovestibular ganglion, Ⅷ）で発現が認められ、耳胞から遊出して内耳神経節を形成する神経前駆細胞にもその発現が認められることが知られている（PNAS USA, 105:　5780 -85, 2008）。その後の検討で、Tlx3は内耳神経細胞へと発生運命の決定した細胞に発現し、Wntシグナル系を介して、知覚性神経細胞を分化・誘導する機能を有していることが明らかとなった(Stem Cells 29: 836-846, 2011)。以上よりTlx3は内耳神経細胞の発生に極めて重要であり、Tlx3は内耳前駆細胞への優れた分化誘導マーカーと考えられる。

そこで本研究では、当初の研究計画に従い、マウスES細胞からの内耳前駆神経細胞への分化誘導法の確立を試みた。具体的にはTlx3遺伝子の翻訳終了点直後にレポーター遺伝子(eGFP)をノックインさせたマウスES細胞を作製した。このノックインES細胞にBMP4やFGF2などを順次添加することで内耳系へ分化誘導した後、Tlx3を発現している内耳前駆細胞を、同時に発現しているGFPを分別マーカーとしてFACS sorterにて選別し、純粋な内耳前駆細胞を作成出来るかどうかの検討を開始している。この工程が上手く行けば、次は動物モデルでの実験に移行する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在の所ほぼ当初の予定通りに研究は進行している。

Strategy for Future Research Activity

Tlx3遺伝子の翻訳終了点直後にレポーター遺伝子(eGFP)をノックインさせたマウスES細胞を作成した。このマウスES細胞が目的どおりに動くかどうかを確認し、上手くいくようであれば、動物モデルでの実験に移行する予定である。万一Tlx3の発現上昇に伴うGFPの発現上昇が見られない場合には、別のtargeting vectorを作成し、再検討を行う。

Causes of Carryover

前年度の残高213,054円は前年度予算の15%程度であり、特に問題はないと考えられる。
本年度に繰り越して使用する予定ある。