2017 Fiscal Year Research-status Report
Isolation of Cancer Stem Cell and Identification of Signalling Pathway Related with Invasion and Metastasis in HPV- Oropharyngeal Cancer
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17K11401
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
グンデゥズ メーメット 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (70333507)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉川 俊次 和歌山県立医科大学, 医学部, その他 (40543781)
戸川 彰久 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (70305762)
保富 宗城 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (90336892)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 中咽頭癌 / HPV / 癌幹細胞 / 頭頚部癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではツルク大学Grenman教授より供与されたHPV(-)中咽頭癌細胞株であるUT-SCC ６０Aを使用した。この細胞株は扁桃癌から樹立されたHPVー中咽頭癌細胞を含んでいる。腫瘍細胞株を特異的な無血清培地で培養した。癌幹細胞特異の細胞抗体（抗ALDH1抗体）にて染色し、MACS(Magnetic Beads Sorting)により、癌幹細胞および癌非幹細胞の分離を成功した。アルデヒド脱水素酵素（Aldehyde dehydrogenase：ALDH）は、アルデヒドの代謝に関与しレチノールをレチノイン酸に変換させる働きをもち、ALDHの活性は正常組織における幹細胞のみならず腫瘍幹細胞においてもみられることが報告されている。分離した細胞株から癌幹細胞であることを下の方法で確認した：
形態的構造相違：培養した細胞株では癌幹細胞群はSphere形成を示し癌幹細胞であることを考慮した。次に癌幹細胞および癌非幹細胞(分化型細胞)から、それぞれTotalRNAを抽出しcDNA作成をした。分離した癌幹細胞を免疫染色および癌幹細胞マーカー遺伝子発現により確認する。逆転写反応を行ってから癌幹細胞に高発現すると考えられるNanog、Sox2、Oct4の発現量をRT-PCR方法で検討した。癌幹細胞株では癌非幹細胞株に比較してこの三の遺伝子すべて高発現を示した。分離した各細胞株をさらに蛍光が付いている抗ALDH1抗体を利用して癌幹細胞であることを確認した。分離した各細胞株をMicroarray解析(GeneChip Human Gene 2.0 ST Array (Affimetrix) 24,838 genes and 11,086 linc RNA)を行った。Microarray解析結果として癌幹細胞株では癌非幹細胞株に比較してHistonClust蛋白コードする遺伝子の好発現を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画通りに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画通り見出した頭頸部癌の癌幹細胞特異的シグナル経路に関連する遺伝子を用い、細胞機能実験において増殖・浸潤・転移・薬剤耐性への関与を検討する。Microarray解析により癌幹細胞と癌非幹細胞を比較し、癌浸潤・癌転移と薬剤耐性に関与している遺伝子の選択をし、癌幹細胞と最も関連がある（癌非幹細胞に比較して）高発現遺伝子と低発現遺伝子を選択し機能解析の対象とする。Loss -of-function実験をする。癌幹細胞にトランスフェクションで高発現している遺伝子を特異的なsiRNAを細胞に導入することによりターゲット遺伝子を抑制する。siRNAは化学修飾された二本鎖の核酸で、内在性のmRNAに特異的に結合し阻害するようにデザインされている。MTTAssay、Chemosensitivity Assay、CellMigrationAssayを行う。
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| Causes of Carryover |
実験材料の購入の調製で次年度に使用する。
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| Remarks |
特になし
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Research Products
(1 results)
