骨吸収抑制・癌免疫エディティングを考慮した新規歯肉癌治療の開発に向けた研究

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11406
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 中平 光彦 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10253353)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 臼井 通彦 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (10453630) ; 佐藤 毅 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (60406494) ; 星島 宏 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (90536781) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 歯肉癌細胞 / MICA / 破骨細胞 / 骨吸収

Outline of Annual Research Achievements

マウスから破骨細胞を形成する実験系を立ち上げることとした。まず、マウスから骨髄細胞を採取した。8～10週齢の雌のC57BL/6マウスの脛骨を取り、近位端と遠位端を切断し、骨髄腔内を10% FBS 及び1% penicillin/streptomycinを添加した培養液alpha modification of Eagle's MEM (alpha MEM)にてフラッシュして細胞をチューブに回収した。回収した骨髄細胞を16～20時間培養し、上清に含まれた非接着細胞を１×105/cm2で別のディッシュに播種し、10 ng/mlのMacrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF)を添加して48時間培養した。培養後の接着細胞は骨髄マクロファージ (BMMs)として、10 ng/mlのM-CSFと100 ng/mlのreceptor activator of NF-kappa B ligand (RANKL)を加えて培養した。5日間の培養後、10% ホルマリンで5分間固定し、エタノールおよびアセトン（容量 50:50）にて1分間再固定した。破骨細胞のマーカー酵素である酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼTartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)を検出するために、naphthol AS-MX phosphateとfast red violet LB saltを添加した50mMの酒石酸含有緩衝液にて室温でTRAP染色を行い3核以上のTRAP陽性細胞を破骨細胞とした。また、MICA遺伝子強制発現Ca9-22細胞においてRANKL発現をリアルタイムPCR法で検討したところ、RANKL遺伝子発現が亢進していた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

歯肉上皮細胞と破骨細胞の細胞実験を開始できていないため。

Strategy for Future Research Activity

MICA遺伝子強制発現Ca9-22細胞の培養上清を破骨細胞前駆細胞であるRAW264.7細胞に作用させ、M-CSFを添加して破骨細胞に分化させる。RNAを抽出してRANK, 等の遺伝子発現を調べる。また破骨細胞分化に対する作用も検討する。

Causes of Carryover

生化学実験関係の消耗品が必要と見込んだ金額よりも少なく済んだため。
翌年度の実験では、生化学実験の消耗品の費用として計上する。