骨吸収抑制・癌免疫エディティングを考慮した新規歯肉癌治療の開発に向けた研究

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11406
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 中平 光彦 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (10253353)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 臼井 通彦 九州歯科大学, 歯学部, 准教授 (10453630) ; 佐藤 毅 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (60406494) ; 星島 宏 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (90536781) [Withdrawn]
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 歯肉癌細胞 / MICA / 破骨細胞 / 骨吸収

Outline of Annual Research Achievements

われわれは以前netrin familyが骨代謝に影響することを見いだしている。具体的にはnetrin-1が骨芽細胞の分化抑制に関わること、netrin-4が破骨細胞の分化を抑制することを見いだした。そこで、本年度はnetrin-4の生体における局在を調べるとともに、卵巣除去マウスを作製し、netrin-4の血中濃度を調べた。まず、C57BL/6 マウスの大腿骨に直径1 mmの穴をドリルにて骨髄まで開けて、１４日目に血管内皮細胞、破骨細胞、netrin-4陽性細胞の位置関係を免疫染色にて調べた。netrin-4陽性細胞はPECAM-1陽性である血管内皮細胞に局在することがわかった。また、TRAP陽性の破骨細胞は血管内皮細胞の近傍に存在することが確認された。次に生後７週齢のメスマウスに対して卵巣除去手術を施行した。対照群は背部に切開を入れる偽手術群とした。術後９週間で安楽死をさせて、発泡スチロールに貼り付け、４％PFAに浸漬して固定、エタノール置換後にMethyl Methacrylate Monomerにて脱水及びembeddingを行なった。ライカRM2255にて脊椎骨のL3及びL4の７μmの切片を作製し、von Kossa染色を行なった。Osteomeasureにて海綿骨骨量を測定したところ、卵巣除去マウスで有意に骨量が低下していることを確認できた。そこで、netrin-4の血中濃度を測定したところ卵巣除去マウスにおいて低下していた。つまりnetrin-4は生理的に血管内皮細胞から産生される可能性、そして閉経後骨吸収の促進に伴い濃度が低下することから生体内において骨代謝を正に制御する役割があることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

NK細胞と歯肉上皮細胞の実験を開始できていないため。

Strategy for Future Research Activity

In vitroでNK細胞にc-Cbl のsiRNAを導入しNKG2D受容体の発現を抑制できるか検討する。NK細胞にc-CblのsiRNAとしてStealth siRNAsの遺伝子導入を行い、MICA強制発現Ca9-22細胞と共存培養を行う。２４時間後に細胞を回収し、NKG2DのmRNA発現をリアルタイムRT-PCRにて解析を行う。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由は、生化学実験関係の消耗品が必要と見込んだ金額よりも少なく済んだためで翌年度の実験では、生化学実験の消耗品の費用として計上する。