Gene editing for corneal dystrophy using CRISPR/Cas9

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11446
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 臼井 智彦 東京大学, 医学部附属病院, 非常勤講師 (80282557)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 角膜

Outline of Annual Research Achievements

本年度は（平成29年度）は、TGFBI関連角膜ジストロフィー患者の手術検体から、角膜実質細胞を培養し、in vitroでの遺伝子編集効果を検討した。
TGFBI遺伝子の変異部位を標的としたguide RNA（gRNA）およびSpCas9-2A-GFP発現プラスミドと、切断部位に組み込む相同組み替えの為のDNA修復テンプレートssDNAを設計し、それらを変異培養細胞にリポフェクション法で共遺伝子導入した。導入後、GFP陽性細胞をFluorescein activated cell sorting (FACS)を用いて遺伝子導入されたと考えられる細胞を回収を行い、回収した細胞のシングルクローンさらに培養し、細胞を増やした後、DNAを抽出し、PCRでゲノムを増幅した。PCR産物を制限酵素処理し、電気泳動（restriction fragment length polymorphism (RFL)Pアッセイ）し、またPCR産物はシークエンスを行ったところ、変異の修正が確認され、編集効率は30%前後であった。
CRISPR-Cas9システムでは、本来期待していない部位に挿入欠損変異が生じる、いわゆるオフターゲット作用の可能性もあるため、T7 endonuclease Iを用いたアッセイも行った。RFLPアッセイやシークエンスの時と同様、gRNAおよびSpCas9-2A-GFP発現プラスミドとDNA修復テンプレートssDNAを変異培養細胞にリポフェクション法で共遺伝子導入し、FACSで細胞を回収後、T7 Endonclease Iで処理し、これを電気泳動によって検出、ならびにシークエンスを行ったところ、オフターゲットは認めなかった。
現在2018年度予定の動物モデルでの検討に着手している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2017年度はin vitroの解析を行い、論文まで作成できたこと。また動物モデルの作成に着手できていること

Strategy for Future Research Activity

予定通り2018年度は動物モデルを用いた解析を続ける。

Research Products

• [Journal Article] Repair of the TGFBI gene in human corneal keratocytes derived from a granular corneal dystrophy patient via CRISPR/Cas9-induced homology-directed repair (2017)
  • Author(s): Taketani Y, Kitamoto K, Sakisaka T, Kimakura M, Toyono T, Yamagami S, Amano S, Kuroda M, Moore T, Usui T, Ouchi Y
  • Journal Title: Scientific Report Volume: 7 Pages: 167113
  • DOI: 10.1038/s41598-017-16308-2
  • Peer Reviewed / Open Access