Bone marrow mesenchymal cell transplantation for corneal stroma regeneration

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11452
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 林 康人 愛媛大学, 医学系研究科, 研究員 (70314953)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白石 敦 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (90314963)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 角膜実質 / ケラトサイト / 骨髄線維芽細胞 / 再生医療 / バイオイメージング / 遺伝子組み換えマウス

Outline of Annual Research Achievements

菲薄化した角膜実質は角膜穿孔を招き、失明の危険がある。我々が考案した骨髄線維芽細胞の角膜実質内注入はケラトサイトマーカーであるケラトカンの発現を得ることができ、角膜移植に代わる治療法として期待されている。バイオイメージングで検討を加えるためには、490nm, 560nmのレーザー以外で励起し、観察が可能な、Cre reporter mouseの作成を不可欠である。そこで、Cre発現細胞を青色蛍光、発現していない細胞を深赤色蛍光で識別できる【ROSA26(mR/mB)】マウスを遺伝子相同組換えにより作製するために、ROSA26 の5'-７kbと3'-3kbの相同組換えアームとCAG promoterをもつROSA26 (CAG-mcs1-loxP- pgkNeo-loxP-mcs2)のmcs1にiRFP670遺伝子を挿入、mcs2にはTagBFP遺伝子を挿入し、ROSA26 (CAG-loxP-miRFP670-pgkNeo-loxP-mTagBFP) を作製した。挿入した遺伝子の塩基配列はGenetic Analyzerで間違いがないことを確認した。ターゲティングベクターをB6由来のES 細胞（HK3i)へ導入を行い、48クローンのコロニーをPCRでスクリーニングをして、24クローンの相同組み換えES細胞を得た。5'-７kbアームおよび3'-3kbアームの外側にプローブを作製し、ネオマイシン耐性遺伝子を加えた3カ所のプローブでサザンブロットを行い14クローンで相同組み換えを確認した。そのうち4クローンを8細胞期のICRマウス胚に注入し、キメラマウスを作製した。キメラマウスをC57BL/6Nメスと交配して、F1マウスを作成し、genotypingを行った。結果、キメラマウス2系統(9と14)においてF1マウスで相同組換遺伝子が確認され、現在はん殖中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究に不可欠な遺伝子組み換えマウス2系統において相同組換遺伝子が確認され、今後の研究の展開が可能になった。

Strategy for Future Research Activity

ROSA26 (CAG-loxP-miRFP670-pgkNeo-loxP-mTagBFP)【ROSA26(mR/mB)】マウスをROSA26 (CAG-loxP -pgkNeo-loxP- mVenus-hGem(1/110)-IRES2- mCherry-hCdt1(30/120)) 【ROSA26(FUCCI2)】マウスおよびROSA26 (CAG- mVenus-hGem(1/110)-IRES2- mCherry-hCdt1(30/120)) 【ROSA26(ΔFUCCI2)】マウスとKeratocan-IRES2-nlsCre【KINC】マウスおよびKeratocan-IRES2-CreERT2【KICE】マウスと交配し、マウスコロニーを確立する。
ROSA26(mR/mB)ホモのオスをES cellの相同遺伝子組換で使用したプローブを用いたサザンブロットで確認し、ライフサイエンス技術基盤研究センターで凍結胚保存する。(他施設へマウス供与)

Causes of Carryover

遺伝子組み換えマウスの作成に伴う費用や動物の運搬に必要な費用として必要である。