Bone marrow mesenchymal cell transplantation for corneal stroma regeneration

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11452
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 林 康人 愛媛大学, 医学系研究科, 研究員 (70314953)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白石 敦 愛媛大学, 医学系研究科, 教授 (90314963)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 角膜実質 / ケラトサイト / 骨髄線維芽細胞 / 再生医療 / バイオイメージング / 遺伝子組み換えマウス

Outline of Annual Research Achievements

菲薄化した角膜実質は角膜穿孔を招き、失明の危険がある。我々が考案した骨髄線維芽細胞の角膜実質内注入はケラトサイトを示すケラトカンの発現を得ることができ、角膜移植に代わる治療法として期待されている。バイオイメージングで検討を加えるためには、490nm, 560nmのレーザー以外で励起し、観察が可能な、Cre reporter mouseの作成を不可欠である。そこで、Cre発現細胞を青色蛍光、発現していない細胞を深赤色蛍光で識別できる【ROSA26(mR/mB)】マウスを遺伝子相同組換えにより作製するために、ROSA26 の5'-７kbと3'-3kbの相同組換えアームとCAG promoterをもつROSA26 (CAG-mcs1-loxP- pgkNeo-loxP-mcs2)のmcs1にiRFP670遺伝子を挿入、mcs2にはTagBFP遺伝子を挿入し、ROSA26 (CAG-loxP-miRFP670-pgkNeo-loxP-mTagBFP) を作製した。ターゲティングベクターをB6由来のES 細胞（HK3i)へ導入を行い、サザンブロットで14クローンで相同組み換えを確認した。そのうち4クローンを8細胞期のICRマウス胚に注入し、キメラマウスを作製した。キメラマウスをC57BL/6Nメスと交配して、F1マウスを作成しgenotypingを行った。キメラマウス2系統(#9と＃14)においてF1マウスで相同組換遺伝子が確認された。Keratocan‐IRES2-nls-Cre【KINC】と交配して、ケラトサイトでmTagBFP、それ以外の細胞でmiRFP670の発現が確認できた。現在、ケラトサイトに分化した細胞で増殖シグナルが同時に観察可能なKINC /ROSA26(mR/mB)/ FUCCIマウスを作成中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2系統(#9と＃14)ともKeratocan‐IRES2-nls-Creとの交配で角膜実質細胞（ケラトサイト）に分化したときに、iRFP670の発現がTagBFPに変化することが確認できた。

Strategy for Future Research Activity

ROSA26(mR/mB)とROSA26 (CAG-loxP -pgkNeo-loxP- mVenus-hGem(1/110)-IRES2- mCherry-hCdt1(30/120))【ROSA26(FUCCI2)マウス】とKeratocan-nls-Creの3つの遺伝子を持つマウスを作成し、骨髄組織を培養して骨髄幹細胞行う予定。

Causes of Carryover

ケラトサイトの3次元構築を色ごとに解析するソフトの作成を依頼しているが、作成に時間を要しているため、次年度への持越しとなった。マウスの作成は１度目のES細胞注入では、キメラからF1マウスを得ることができず、２度目のES細胞注入でF1マウスを得ることができたが、理化学研究所との取り決めでhomozygousの繫殖可能な雄を凍結胚保存のために、供与するための費用が次年度への持越しとなった。それ以外の研究については、当初の予定通りに進行しており、問題はないと考えている。