網膜色素上皮細胞とマイクログリアの相互作用と眼内増殖膜への影響に関する研究

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11457
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 高橋 枝里 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (60622602)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福島 美紀子 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (10284770) ; 猪俣 泰也 熊本大学, 医学部附属病院, 助教 (50452884) [Withdrawn] ; 谷原 秀信 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (60217148)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 網膜色素上皮細胞 / 上皮間葉転換 / 線維化

Outline of Annual Research Achievements

網膜色素上皮細胞はその活性化により様々な液性因子を分泌すると考えられ、その結果、血管新生や眼内の線維化の一要因であると考えられている。また、その活性化状態により様々な炎症細胞、グリア細胞が活性化、遊走すると考えられる。網膜色素上皮細胞が分泌する液性因子として、特にエキソソームに注目をした。エキソソームはそのvesicle内にタンパクやｍRNA、miRNAなど多くの情報を内包し、異種細胞間の情報伝達に大きな役割を担っているとして、近年注目されている。我々は網膜色素上皮細胞（ARPE-19）にTNF-α、TGF-β２刺激（単独刺激、共刺激）を行い、上皮間葉転換（EMT)を誘導した後、その培養上清を回収し、EXOQUIC試薬を用いてエキソソーム抽出を試みた。無血清培地での培養下ではエキソソームを抽出できず、１０％FBS（エキソソーム無添加）下、TNFーα、TGF-β２刺激を行い、培養上清を回収し、エキソソームを抽出した。ウエスタンブロットにより、抽出したペレットはエキソソームマーカーであるCD9,HSP70の発現を認め、細胞成分であるGM１３０は認めなかったことから、エキソソームが抽出されていると考えられる。さらに、エキソソームELISAを用いたところ、TNF-α存在下に特にエキソソーム分泌が亢進することがわかった。抽出したエキソソームについてはさらに今後、particleの直径、数ともに解析予定である。今回使用したARPE-19細胞に加え、primaryRPE細胞でも同様の実験を行い確認予定である。そのうえで。抽出したエキソソームに関してはマイクロアレイにより、上皮系、間葉系の状態による内包する情報の違いを解析していきたい。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

液性因子同定に想定以上の時間がかかり、マイクログリアとの共培養まで至っていない

Strategy for Future Research Activity

エキソソームの解析をすすめ、線維化に関連する、特にmiRNAを同定する。また、エキソソームのenvelopの解析も行い、構成タンパクの違いによるマイクログリアのエキソソームの取り込みの違い等の検討を行う予定である。

Causes of Carryover

学会参加がなかったことと、確認実験が多く新規の試薬を購入する必要が少なかったため。次年度使用としては、学会に参加予定であること、また、必要な新たな解析を行う予定である。