2017 Fiscal Year Research-status Report
網膜ミュラー細胞の分化に関わる転写因子群の標的遺伝子遷移と再生能賦活化の解析
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17K11491
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
須藤 則広 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (80646216)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 網膜発生 / 転写制御 / エピジェネティクス / 網膜再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
網膜ミュラー細胞は網膜前駆細胞と転写因子の発現が極めて類似しており、成体幹細胞と考えられているが、哺乳動物においてほとんど再生能は示さない。その理由はミュラー細胞における多分化能や神経分化に関わる遺伝子カスケードの消失にあるのではないかと推測している。本研究では網膜前駆細胞とミュラー細胞に共通して発現している転写調節因子（転写因子）を選びその標的遺伝子およびエンハンサーの変化について、エピジェネティクス修飾と相関させて網羅的に解析を行うことを計画している。共通して発現している転写因子はrax、pax6、sox9、lhx2、chx10遺伝子を候補とし、これらの遺伝子発現変化をRNA-シーケンス（RNA-seq）、標的遺伝子の変化をクロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-seq）で解析する。初年度は上記実験を行う上での予備的実験と補足的情報収集を行った。
１．網膜の分散条件の検討：ミュラー細胞は網膜組織の2-3％程度しか存在しない。その為より多くのミュラー細胞を回収する為に細胞を侵襲しない条件での組織分散が重要となる。条件検討の結果より細胞死をより減少させた条件が決定された。
２．リアルタイムPCRを用いた転写因子、エピジェネティクス因子、リプログラム関連因子の発現解析：RNA-seq並びにChIP-seq解析を行う為の最適な時期の特定およびその結果を検証する為のコントロール実験を行った。発生期から成体に至る過程における遺伝子発現変化を60遺伝子以上調べた。
３．網膜の初代培養系を用いた遺伝子発現解析：マウス網膜組織ではin vitro条件においてミュラー細胞だけが細胞周期に再進入する。その際の遺伝子発現変化をリアルタイムPCRで調べた。この時発現変化している遺伝子はおそらく生体内でも必要となる遺伝子と推測される。本研究を遂行する上で網膜再生の際の有用な参考情報が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概ね順調に進行しているが、網膜内のミュラー細胞の数（分離できる数）が思った以上に少ない印象を受けている。この点を十分に解決しないとこの後の実験に支障をきたすので十分に検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
網膜前駆細胞とミュラー細胞におけるrax、pax6, sox9, lhx2, chx10遺伝子の標的遺伝子およびその転写量がどのように遷移しているのかChIP-seqおよびRNA-seqにより解析を行う。平成30年度はまず胎生期の網膜前駆細胞と成熟ミュラー細胞の解析を行う。その後に生後網膜前駆細胞との比較を行う予定である。上記の解析により、単なる網膜前駆細胞とミュラー細胞の比較だけでなく、網膜前駆細胞の分化能が限局される過程およびミュラー細胞の成熟過程それぞれにおける転写制御ネットワークの遷移も解析可能となる。本実験を行うにあたり必要とされる細胞分離であるがセルソーターを用いることを予定しているが、より簡易で安価な磁気ビーズを用いたMACSによるミュラー細胞の分離も検討している。上手く出来れば時間も短縮できその分細胞への影響も少なくできると考えられる。ChIP assayにおいて抗体の特異性は結果を大きく左右するものであるので、その特異性については、抗体染色やクロマチン免疫沈降定量PCRにより十分に検討を行う。ChIP-seq解析は基本的に外部に委託する予定である。またデータ解析は基本的に自身で行う予定である。最近は解析の為の講習会も頻繁に開かれておりこれらも積極的に活用し、問題点に関しては外部研究者に協力を仰ぐ予定である。ChIP-seqとRNA-seqの結果をもとに、転写因子の転写ネットワークモデルを構築する。具体的には胎生期の網膜前駆細胞と成熟ミュラー細胞のrax、pax6, sox9, lhx2, chx10遺伝子の標的遺伝子遷移やエンハンサーの切り替えなどを明らかにする予定である。更にエンハンサーの活性の真偽についても検証を加える予定である。
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| Causes of Carryover |
注文後の納品に時間がかかっている試薬があった為。またChIP-seqおよびRNA-seqを行う為の予算でもあるが、より慎重に条件検討を行ったことで使用時期がずれ込んだ。従って計画通りに実験を遂行する予定である。
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Research Products
(5 results)
