網羅的RNA解析をもちいた杆体細胞錐体細胞分化機構の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11494
• Research Institution: St. Marianna University School of Medicine
• Principal Investigator: 鈴木 知子 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (80598756)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鈴木 登 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 教授 (40235982)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 視細胞分化 / 甲状腺ホルモン合成経路 / SOD1 / Bcl2

Outline of Annual Research Achievements

我々はマウス ES細胞とiPS細胞から安定した株化網膜前駆細胞を樹立した。そのうちの一部の細胞株は視細胞前駆細胞としての性質を持ち、ケモカインSDF1に反応して優先的に杆体視細胞、MCP1に反応して優先的に錐体視細胞へと分化する。その分化機構を転写因子レベルとエピジェネティック調節のレベルで解析した。種々の濃度のSDF1を添加して、経時的に細胞株を回収後、次世代シークエンサーを用いて各細胞の全転写パターンを分析した。同様にMCP1を添加した培養系も作成し、同様に解析した。
得られたデータをKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) databaseを対象にiPathwayGuideを用いたBioinformaticな解析を行った。具体的にはq valueの閾値を1として(cut off無しで)多変量解析法を実施した。その結果、非刺激状態に比較してSDF1刺激ではThyroid hormone synthesis経路が活性化されていることが示された。
既に視細胞のconeへの分化にはThyroid hormone Receptorβ以下の経路が重要に関わることが知られているが、我々の成績はThyroid hormone synthesis経路とThyroid hormone Receptorβ以下の経路の両者が視細胞分化に必要な事を示している。
同様の解析の結果からSuperoxide dismutase (SOD)1と抗アポトーシス蛋白Bcl-2が関わるAmyotrophic lateral sclerosis (ALS)経路も視細胞分化に必要な事が示された。
現在、これらとは別の代謝経路に関する解析は進行中であり、今後の進展が待たれる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の研究計画に則って順調に研究成果が蓄積されている。
今後は、同定された遺伝子の発現をRT-PCR法やウエスタン法で解析していく予定である。

Strategy for Future Research Activity

当初の研究計画では、まだ実用的ではなかったsingle cellでの解析が、比較的容易になってきた。複数の企業から、single cell からのtotal RNA解析が可能な実験キットが市販されるようになった。ここまでは種々の分化段階の細胞を含むheterogenousな視細胞前駆細胞を用いて解析を行ってきたが、今後はsingle cellを用いたtotal RNA解析を行う。

Causes of Carryover

実験は最少の費用でこれまで順調に進展してきた。本解析の周辺技術の進展によりsingle cellレベルでのtotal RNA解析が比較的容易に実施できるようになってきている。今後は、新規に発売されたsingle cell でのtotal RNA解析を導入して、これまでの細胞集団で得られた実験結果とsingle cellで得られる結果を比較する予定である。そのために差額を使用する予定である。