2017 Fiscal Year Research-status Report
結膜線維芽細胞における慢性炎症型の表現型獲得に必要なエピジェネティクス機構の解明
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17K11500
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| Research Institution | National Center for Child Health and Development |
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Principal Investigator |
岡田 直子 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 免疫アレルギー・感染研究部, (非)研究員 (50636165)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | アレルギー性結膜炎 / 線維芽細胞 / エピジェネティクス / ペリオスチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度の研究では、まず申請書項目１に基づき、重症アレルギー性眼疾患患者由来の線維芽細胞で高発現する遺伝子群の中から、特にエピジェネティクス変換に重要な候補因子の探索を行った。重症アレルギー性眼疾患患者由来結膜線維芽細胞をマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子発現解析を行い、様々なバイオインフォマティクスツールを用いて詳細に分析した。その結果、重症アレルギー性眼疾患由来線維芽細胞において正常由来線維芽細胞によりも統計学的に有意に発現変動することが明らかになった遺伝子は1078個あった。さらにペリオスチン遺伝子発現と関連性の高い遺伝子群を探索するため、相関解析を実施したところ、686個の遺伝子が抽出された。抽出された遺伝子からは、いくつかのサイトカインおよびその受容体、転写因子、ヒストン脱メチル化酵素などが新たに発見され、エピジェネティクス制御に関わる新たな候補因子である可能性が示唆された。また、重症アレルギー性眼疾患由来線維芽細胞において発現上昇する遺伝子群が、どのようなシグナル経路によって発現誘導されているかを、Ingenuity Pathway Analysis (IPA)を用いて調べた。その結果、TGF-β, IL-1, TNFがもっとも関連性の高い遺伝子として予測された。TGF-βおよびIL-1は、正常結膜線維芽細胞において持続性のペリオスチン発現を誘導できることを先行研究ですでに明らかにしている(平成27-28 年度科研費若手B)。よって、これらの下流シグナル分子が、重症アレルギー性眼疾患の実際の病態においても、結膜線維芽細胞が慢性炎症型へエピジェネティック変換される際に機能している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的通り、重症アレルギー性角結膜炎患者由来の結膜線維芽細胞におけるエピジェネティック誘導系の変換に重要な候補遺伝子の絞り込みについて、目標の成果を得ることができた。一方、TGF-βやIL-1の下流分子について、ペリオスチン発現をエピジェネティックに誘導できる候補分子の絞り込みについては、対象となる遺伝子が予想よりも多数存在したため、当初の研究計画よりも遅れている。このため次年度は、初年度に重症アレルギー性角結膜炎患者由来の結膜線維芽細胞の解析結果より抽出された候補遺伝子を対象として、TGF-βやIL-1がこれらの分子誘導に関与しているかどうかを検証することで、候補遺伝子の絞り込みを進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年度に得られた結果を基にして、引き続きペリオスチン遺伝子のエピジェネティクス制御因子の絞り込みを行う。具体的には、初年度に抽出、予測されたエピジェネティック候補因子について、すでにエピジェネティクス変換のために重要な分子として同定されているTGF-βやIL-1の下流分子として動いているかを検証するために、健常ドナー結膜線維芽細胞へサイトカインの長時間刺激を行い、下流シグナルを経時的な変動をqPCR、ELISA、ウェスタンブロッティング法などで解析する。また、この際に薬剤感受性（FK506、ステロイドおよびヒストン脱アセチル化酵素阻害剤などを予定）も並行して検証する。ここまでの解析で、共通する遺伝子を絞り込み、最終的に慢性炎症型線維芽細胞のエピジェネティック誘導に必要な候補因子の抽出を行う。
次に、申請書項目２に基づき、今年度の検討でさらに厳しく選抜されたエピジェネティック誘導候補因子について、Lipofection法またはレンチウィルスベクターを用いた遺伝子の強制発現系を構築し、実際にエピジェネティック変換を伴うペリオスチンの発現誘導を起こすかどうか、qPCR, ELISAで確認する。
さらに申請書項目３に基づき、項目２の強制発現系で成果があった分子についてsiRNAを設計する。Lipofection法により重症アレルギー性眼疾患患者由来結膜線維芽細胞への導入を行い、ペリオスチンの発現誘導への影響をqPCR, ELISAで確認する。
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| Causes of Carryover |
購入を予定していたいくつかの抗体および汎用試薬について、実験系における使用量の節減が効率よくできたため、購入の必要がなくなった。これらは、次年度に予定しているsiRNA関連試薬の購入費用の補てん分としたい。
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