敗血症性DICにおけるカルシウム非依存性ホスホリパーゼA2の役割

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11567
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 相星 淳一 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (50256913)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 哲幸 お茶の水女子大学, 基幹研究院, 教授 (50178323)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: カルシウム非依存性ホスホリパーゼA2 / 血小板 / 敗血症 / 播種性血管内凝固症候群

Outline of Annual Research Achievements

ホスホリパーゼA2（PLA2）は、細胞質性PLA2（cPLA2）、分泌性PLA2（sPLA2）、カルシウム非依存性PLA2（iPLA2）の三つに大きく分類される。これまでの研究から、好中球、マクロファージ、血管内皮細胞などに存在するiPLA2は急性炎症に関与することが報告されている。血小板内にはcPLA2、iPLA2γ、iPLA2βの酵素が存在する。コラーゲン、トロンビン、ADPなどの刺激物質に対してPLA2は活性化し、その結果、産生されたアラキドン酸やその代謝産物であるエイコサノイドは血小板機能において重要な役割を演じるが、血小板活性化のシグナル伝達や播種性血管内凝固症候群の病態におけるiPLA2 の役割は十分に解明されていない。したがって、本研究の目的は、①ヒト血小板の活性化（凝集能、細胞内カルシウム上昇、接着分子発現、脱顆粒、アラキドン酸・エイコサノイド産生）におけるiPLA2 の酵素学的機能について、各種PLA2 に対する特異的阻害剤（Pyrrophenone、R-BEL、S-BEL）を使用して検討する。②ラット敗血症モデルを使用して、DIC の病態におけるiPLA2 の関与について、一般的な凝固線溶系マーカー検査（血小板数、フィビリノーゲン、D-dimer、プロトロンビン時間、活性部分トロボプラスチン時間など）やthromboelastography（TEG）を用いて凝固・線溶系の状態を分析する。
2018年度のおもな実績としては、コラーゲン刺激による血小板凝集反応において、cPLA2とiPLA2βの関与が示唆された。また、凝固線溶反応にcPLA2酵素が寄与する可能性がある。他の血小板機能（セロトニン遊離、トロンボキサンB2・アラキドン酸産生）を分析するためのサンプル集積を開始した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

血小板凝集反応におけるcPLA2、iPLA2γ、iPLA2βの役割を明らかにするため、それぞれに対する特異的阻害剤（Pyrrophenone、R-BEL、S-BEL）を使用して阻害実験を行った。コラーゲン刺激に対する血小板凝集はすべての阻害剤で濃度依存的に抑制された。R-BELとS-BELの効果を比較すると、S-BELは有意に凝集反応を阻害したことから、コラーゲン刺激による血小板凝集反応にはcPLA2とiPLA2βが強く関与する可能性がある。また、凝固線溶反応におけるcPLA2、iPLA2γ、iPLA2βの関与を確認するため、TEGによる測定を開始した。cPLA2は凝固線溶反応における血小板凝集を抑制した。さらに、セロトニン、トロンボキサンB2、アラキドン酸産生に対する阻害効果を検討するため、サンプルの集積を始めている。

Strategy for Future Research Activity

2019年度は、トロンビン刺激に対する血小板凝集反応、凝固線溶反応、セロトニン、トロンボキサンB2、アラキドン酸産生において、Pyrrophenone、R-BEL、S-BELの阻害効果を比較検討する予定である。また、コラーゲン、トロンビン刺激に対する接着分子発現について、flow cytometryを用いてcPLA2、iPLA2γ、iPLA2βの役割を検証する。
上記の研究と並行して、ラット敗血症モデルの作製を継続する。

Causes of Carryover

購入を予定していたPGE1の金額に不足が生じたため、次年度の助成金と合わせて購入を行う。