2018 Fiscal Year Research-status Report
歯周病菌P. gulaeの歯肉上皮細胞への感染成立と歯周病発症メカニズムの解明
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17K11612
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
稲葉 裕明 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (70359850)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
仲野 道代 (松本道代) 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (30359848)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | P. gulae / 付着侵入 / 歯肉上皮細胞 / インテグリン / 歯周病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究費では、動物由来歯周病菌Porphyromonas gulaeのヒト歯肉上皮細胞への感染能を明らかにし、本菌と歯周病発症との関連性を理解することと、その制御法につながる知見を得ることを目的としている。P. gulae は線毛タンパクを構成するFimA遺伝子の塩基配列の違いに基づき線毛をA, B, C型の３タイプに分類されている。本年度研究は、P. gulae 線毛タイプが歯肉上皮細胞への付着侵入におよぼす影響を検討する。さらに線毛ノックアウト株の作製を行った。Ampicillin/Gentamicin protection assay により、P. gulae 各線毛タイプ株のヒト歯肉上皮細胞株Ca9-22株（ヒト歯肉癌由来）への付着侵入を解析した。P. gulae はA型線毛株： ATCC 51700株とDO66株、B型線毛株： DO40株とDO44株、C型線毛株： DO49株とST9-1株の各線毛保有株2株ずつ準備し検討した。付着侵入能の条件は、一昨年度に確立した条件で行った。P. gulae 6株中、全ての菌株が歯肉上皮細胞に付着するものの、C型線毛保有の2株とB型線毛保有株1株のみが細胞内に侵入することが明らかになった。さらに、これらの現象を走査型ならびに透過型電子顕微鏡で撮影することができた。また、C型線毛保有株の細胞内侵入能は、ヒト由来歯周病菌P. gingivalis 菌の中で、最も宿主傷害能を有するII型線毛保有株と同等の侵入能を有することも明らかになった。線毛ノックアウト株の作製線毛遺伝子プロモーター領域と下流領域との間にfimA遺伝子箇所をエリスロマイシンカセットに入れ替えたコンストラクトを作製中である。またこちらの作製が遅れた場合の対応として、C型線毛中和抗体の準備が完成しており、付着侵入能実験に用いる予定にしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト歯肉上皮細胞を用いたP. gulaeの付着侵入能の解析は、おおむね順調に進展している。本年度研究では、走査型／透過型電子顕微鏡撮影ならびにAmpicillin/Gentamicin protection assay を用いて、P. gulaeが保有する線毛遺伝子別の付着侵入能を明らかにした。さらに、P. gingivalis との侵入能を比較することができた。一方、線毛ノックアウト株は、遺伝子導入用コンストラクトを作製中であるが、やや遅れ気味かと思われる。そのため、C型線毛中和抗体の準備を同時におこなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞機能に関わる阻害剤、菌の代謝機能、タンパク合成、RNA合成、DNA合成ならびにプロテアーゼに関わる阻害剤を用いて、P. gulae の歯肉上皮細胞への付着侵入経路を解析する。線毛ノックアウト株を作成し、線毛の付着侵入に関わる影響を明らかにする。しかしながら、線毛ノックアウト株の作成が間に合わない場合は、既に完成済みのC型線毛中和抗体を用いて、P. gulae の付着侵入への影響を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
平成３０年度では、線毛遺伝子ノックアウト株作成のために線毛遺伝子の上流部と下流部に該当する未知の塩基配列を完了し、遺伝子導入のためのコンストラクトを作成していた。しかしながら、コンストラクトの作成が遅延しており、同実験に該当する経費を未使用にしたため次年度使用額が生じた。一方で、代替の実験として抗線毛抗体による実験の準備をおこなっている。平成３１年度では、今回生じた次年度使用額の経費をコンストラクトの作成と抗線毛抗体を用いた代替実験に充当する予定にしている。
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[Journal Article] Identification and molecular characterization of Porphyromonas gulae fimA types among cat isolates.2019
Author(s)
Naoki Iwashita, Ryota Nomura, Mitsuyuki Shirai, Yukio Kato, Masaru Murakami, Saaya Matayoshi, Tamami Kadota, So Shirahata, Leo Ohzeki, Nobuaki Arai, Junya Yasuda, Hidemi Yasuda, Hiroaki Inaba, Michiyo Matsumoto-Nakano, Kazuhiko Nakano, Fumitoshi Asai.
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Journal Title
Veterinary Microbiology
Volume: 229
Pages: 100-109
DOI
Peer Reviewed
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