2018 Fiscal Year Research-status Report
癌原性口腔レンサ球菌の発癌機序におけるヒト歯肉上皮ＡＩＤ異所性発現誘導
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17K11623
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
佐々木 実 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (40187133)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石河 太知 岩手医科大学, 歯学部, 助教 (10569247)
下山 佑 岩手医科大学, 歯学部, 講師 (90453331)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | S. anginosus / AID / 口腔癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
AIDは通常B細胞でしか働かないといわれているが、Helicobacter pyloriに感染したマウスの胃粘膜上皮細胞等で過剰発現していることが明らかとなった。従って本菌による感染発癌機構にAIDの異所性発現が関与していることが示唆されている。我々はこれまで口腔レンサ球菌の一菌種で口腔扁平上皮癌の原因因子として報告されているStreptococcus anginosusにおいても口腔癌組織においてAIDの異所性発現が関連することを報告した。本研究では、S. anginosusによる細菌性生物発癌機序の解明を目的として、菌由来生理活性物質SAAの正常歯肉上皮細胞へのAID発現誘導、ならびにSAA遺伝子のクローニングさらにその組換タンパク質を作製し、SAAによる正常歯肉上皮細胞へのAID異所性発現ならびにiNOS誘導さらにはp53変異誘導について検討する。
現在、 S. anginosus菌由来生理活性物質SAAの正常歯肉上皮細胞へのAID発現誘導を検討し、明らかな異所性発現を認めた。さらにSAAの同定および遺伝子のクローニングさらにはリコンビナントタンパク質の発現について検討した。精製SAAを二次元電気泳動後、特異抗体と反応するスポットをLC/MS解析し、既存のS. anginosus由来タンパク質と同定できた。遺伝子の解析をゲノムライブラリーから検討し、本遺伝子を発現ベクターにクローニング、さらには大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質の発現にも成功した。 また、SAAによる正常歯肉上皮細胞へのAID異所性発現ならびにiNOS誘導さらにはp53変異誘導に関わる細胞内シグナル伝達経路を明らかにするための実験を開始している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
リコンビナントSAAによる細胞内シグナル伝達系について、NF-κBの活性化はpGL4.32[Luc2p/NF-kB-RE/Hygro]Vectorを用いたレポーターアッセイによるルシフェラーゼアッセイで検討した。すなわち，歯肉上皮細胞にベクターをトランスフェクトし、解析することでSAA刺激後のNF-kB活性化を認めた。また、MAPKの活性化についてはSAA刺激した歯肉上皮細胞をSDS-PAGE後に抗リン酸化ERK、JNK、p38抗体を用いてECLウエスタンブロッティングで解析した。さらに、PI3K等の経路についても各種阻害剤を用いることで活性化される細胞内シグナル伝達経路を明らかにしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はSAAの活性中心を解析するために、リコンビナントSAAを全長、N末、C末等の部分発現を行いiNOS mRNAを指標に活性ドメインを特定する。さらに、p５３変異についてリコンビナントSAAで刺激した細胞からゲノムDNAを精製し、p53の各エクソンに対するプライマーを用いたPCRで各PCRフラグメントを増幅する。それらフラグメントをシークエンスキットで反応させたのちDNAシークエンサーを用いた解析から検討する。
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| Causes of Carryover |
細胞内シグナル伝達経路の解析において、当初予定していた阻害剤をすでに保有していたため、新たに購入しなくて済みその分の予算を執行しないで済んだ為。
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