2018 Fiscal Year Research-status Report

Elucidating the regulatory mechanisms of Prg4 expression by the formation of the transcriptional complex including Irx3 on its promoter

Research Project

Project/Area Number	17K11636
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	玉村禎宏徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学域), 助教 (70431963)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	軟骨細胞 / Irx3 / Prg4
Outline of Annual Research Achievements	Prg4は関節軟骨最表層に発現する液性因子で、関節軟骨の潤滑化と変形性関節症の病態進行の抑制に関わることが報告されているが、その遺伝子発現調節機構は不明な点が多い。転写調節因子Irx3は関節軟骨表層に発現することから、我々はIrx3のPrg4遺伝子発現調節に対する役割について着目してきた。まず、C3H10T1/2細胞にshRNAを用いたIrx3発現ノックダウンとTGFb1処理を行ったところ、TGFb1によるPrg4発現上昇が有意に抑制された。この結果から、Irx3発現はTGFb1によるPrg4発現調節に必要であることが示された。さらに、CRISPER/Cas9法を用いたIrx3ノックアウト細胞を作成し、同様の実験を行う予定である。また、我々は、変形性関節症関連遺伝子Nfatc2 、TGFbシグナル伝達因子Smad3、およびIrx3が相互作用することを見出しており、Irx3およびNfatc2は、単独ではPrg4発現誘導作用がないことも判明している。これらの結果から、Prg4遺伝子のプロモーター上のSmad3結合部位の同定を試みている。すなわち、Prg4遺伝子転写開始部位から約3kb上流のSmad3結合部位に着目したChIP assayを行っている。今後は、以上の解析によりPrg4プロモーター領域のSmad3結合部位が同定できた場合、同領域を含む遺伝子配列にluciferase遺伝子をつなぎ、Samd3とIrx3やNfatc2発現によるレポーターアッセイを行う。さらに、同領域に対するChIP-reChIP assayにより、Smad3とIrx3、およびSmad3とNfatc2の複合体のPrg4発現調節領域上での複合体形成を調べる予定である。また、Smad3抗体を用いたChIP-Seqにより、網羅的にPrg4遺伝子発現調節領域のSmad3結合部位を調べることも検討中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ChIP-seqは受託試験として依頼するため費用がかかることが予想されるため、予備実験としてSmad3標的因子として既に報告されている遺伝子についてChIP assayを行い、ChIP assayの条件検討を行っていたことが、研究課題の実施がやや遅れている理由である。
Strategy for Future Research Activity	Prg4転写開始上流領域におけるSmad結合部位をWEBから調べ、同領域に対するChIP-reChIP assayにより、Smad3とIrx3、およびSmad3とNfatc2の複合体のPrg4発現調節領域上での複合体形成を調べる方法も検討する。
Causes of Carryover	当該年度は予備実験による実験系の確立に時間を費やし、当初予定の受託研究に使用する必要がなくなったためである。次年度は、受託研究を含めた実験に使用する予定である。