2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K11676
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
大西 智和 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 准教授 (30244247)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松口 徹也 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 教授 (10303629)
柿元 協子 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (40274849)
楠山 譲二 鹿児島大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (70596105)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | JNK / iTreg / DUSP16 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯周病は、歯肉溝内の歯周病菌を排除するための免疫応答が過剰に働くことにより歯周組織が破壊される疾患である。免疫応答の司令塔として 4 種のヘルパーT ( Th ) 細胞が知られ、Th1、Th2及びTh17 細胞はそれぞれ特徴的なサイトカインを分泌することで免疫応答を刺激する.しかし、調節性Th細胞(iTreg)は逆に免疫抑制性の働きを持つ。そこで、歯周炎の発症には、iTreg の分化が阻害され免疫応答が過剰に働いているという仮説を立てた。
まず、このiTreg分化に関わるシグナル分子JNK1/2を不活化するDual Specificity Phosphatase 16 (DUSP16)というJNK1/2特異的脱リン酸化酵素をT細胞特異的なプロモーターを用いドミナントネガティブ型DUSP16をT細胞特異的に発現するトランスジェニックマウス (DUSP16DN-Tg) を作製した。このマウスのリンパ球は JNK1/2 活性が高く、理論上iTreg細胞が優位であると考えられので、過剰な免疫は起こりにくく歯周病の進行は抑制されると考えられる。そこで、本研究では DUSP16DN-Tg マウスを用い本研究室で開発した方法により実験的歯周炎を誘発し、炎症の程度や歯槽骨吸収のレベルを野生型マウスの実験的歯周炎と比較した。また、iTreg細胞の生体内の分布を目根起訴し学的方法やリアルタイム RT-PCR 法にて検討した。その結果、DUSP16DN-Tgマウスでは歯槽骨の吸収が野生型と比べ減少し、その原因の一つとして iTreg が増加による過剰な免疫機能の抑制が考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DUSP16DN-Tgマウスおよび野生型マウス（Ｃ57ＢＬ/6）にwire ligatureにて実験的歯周炎を誘発した。マイクロＣＴにて歯槽骨の吸収を観察すると、5日間では差がほとんど認めらなかったが10日間では有意にDUSP16DN-Tgマウスでは吸収が少ないことがわかった。また、iTregの分化を制御する転写因子であるFoxP3発現がDUSP16DN-Tgマウスの少ないことが予想される。よって、脾臓においてFoxP3 mRNAの発現をリアルタイムRT-PCR法にて検討したところ野生型に比べ高くiTregが多く存在したので、実験的歯周炎を誘発したマウスの歯周組織を免疫組織化学的に抗FoxP3抗体を用いて観察した。その結果、実験的歯周炎では歯根膜へのリンパ球の浸潤が認められ、その中に5日目のDUSP16DN-Tgマウスの歯周炎側の歯周組織には野生型に比べ多くのiTreg細胞が認められた。しかし、高度に歯槽骨吸収が認められた１０日目の実験的歯周炎誘発モデルにおいてはDUSP16DN-Tgマウスと野生型マウスにおいてiTreg分布の差は認められなかった。次に、インターフェロンγ等のサイトカインの局所の投与による、吸着させた実験を行っており、歯槽骨の吸収促進が認められているが再度の検討の予定である。。
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| Strategy for Future Research Activity |
DUSP16DN-Tg マウス由来骨髄細胞を移植したマウスの実験的歯周炎誘導を行う予定である。方法は、まず野生型マウスに 3Gy の X 線を照射し骨髄障害を誘導する。次に、 DUSP16DN-Tg マウス骨髄より採取した細胞を移植することで、 DUSP16DN-Tg マウスのリンパ球による入れ替えを行う。続いて実験的歯周炎を誘導しマイクロ CT による歯槽骨吸収の測定を行う。また、実験的歯周炎の病期による iTreg に加え Th1、Th17 の推移の検討を、免疫組織学的及びフローサイトメトリーを用いて行う。この実験により、DUSP16DN を発現している T 細胞の役割がより正確に判明する。
In vitro実験系としてのDUSP16のiTreg細胞の分化・機能における役割を検討する. Native CD4+T 細胞を野生型または DUSP16DN―Tg マウスの脾臓から採取し、iTreg を含む Th 細胞分化のための培養を行い、分化させたiTregなどについてフローサイトメトリー解析を行う。そして、分化させたiTregを含むTh細胞をマーカー染色後、セルソーターにて細胞を採取する。そして iTreg または Th17 細胞活性化のためにそれぞれ IL-10 または IL-2 にて処理し、機能を制御する転写因子 (FoxP3）の発現をリアルタイム RT-PCR 法にて観察する。
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