2017 Fiscal Year Research-status Report

レーザー照射による歯髄－血管・神経相互作用へ及ぼす影響の解明

Research Project

Project/Area Number	17K11713
Research Institution	Meikai University
Principal Investigator	増田宜子明海大学, 歯学部, 准教授 (10297038)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	友村美根子明海大学, 総合教育センター, 教授 (30217559) 肖黎日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (80548256)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	スフェロイド / 歯髄細胞 / 血管内皮細胞 / レーザー
Outline of Annual Research Achievements	ラット歯髄細胞を下顎切歯より採取しαMEMにて培養した。Matrigel法によって３次元培養を行った。Falcon REF 353097 の8.0 um のTrans well を用いて細胞を24 wellに培養してスフェロイド作成を行った。24 wellに100 ul づつMatrigel を分注した。37度で10分静置し固まったら細胞懸濁液1 x 10 6 cells/ml を500 ul 入れた。37度で培養した。歯髄細胞のみと歯髄細胞と血管内皮細胞とを３対１の割合で混ぜスフェロイドを作成した。石灰化誘導培地にて石灰化を誘導し４週間後にRNAを調整した。また４週間後にホルマリンにて固定しパラフィン切片を作成した。HE染色を行った。血管内皮細胞と混ぜたもののほうが石灰化が促進していたが、４週間後の切片にて細胞の核が認められずスフェロイド作成が難しい状況と判断した。３回行ったが同様の結果となった。血管内皮細胞を検出する抗体CD31（rabbit polyclonal antibody)にて免疫組織染色を行ったがスフェロイドの細胞自体が失活しているため実験を改めるとここした。スフェロイド自体の培養にかなりの時間がとられてしまい血管内皮細胞との相互作用やレーザー照射による石灰化への影響を期間内に調べることが困難と判断した。まずは単層培養から行うこととした。単層培養にてラット培養歯髄細胞と血管内皮細胞とを１対１、３対１、歯髄細胞のみ、血管内皮細胞のみにおいて６well plateにて培養しNd:YAG レーザーを0.5 W, 100 mJ 5 pulses 30 秒　細胞から3 mm離して照射した。７日、１４日、２１日後に細胞を採取しRNAを精製した。real time PCR のためのTGF-beta 1, Osteocalcin, Dsppのプライマーを作成し実験を行っている。再現性の確認にために現在細胞培養並びにレーザー照射の実験を行っているところである。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 歯髄細胞および血管内皮細胞での３次元培養にてスフェロイド作成を行いスフェロイドを確認したが、４週間培養した後、組織切片を作成したところ細胞に核が認められなくなり細胞自体が失活していることが判明した。スフェロイド作成を数回繰り返したが改善されないため３次元培養での実験を一時中断し、２次元培養にて歯髄細胞と血管内皮細胞との共培養によるレーザー照射の影響を調べることとした。そのため実験が計画よりも遅れている。
Strategy for Future Research Activity	単層培養にてラット６匹の下顎切歯より歯髄細胞を採取し血管内皮細胞を旭硝子から購入し共培養を行う。ラット培養歯髄細胞と血管内皮細胞とを１対１、３対１の割合で共培養するもの、歯髄細胞のみ、血管内皮細胞のみにおいて培養するものとに分ける。Primary cultureにてサブコンフルエントに達したら６well plateに継代培養しNd:YAG レーザーを照射する。0.5 W, 100 mJ 5 pulses 30 秒　細胞から3 mm離して5 spots/ well で照射した。７日、１４日、２１日後に細胞を採取しRNAを精製する。real time PCR のためのTGF-beta 1, Osteocalcin, Dsppのプライマーを作成し再現性の確認を行う。
Causes of Carryover	歯髄細胞と血管内皮細胞との共培養のスフェロイド作成時に細胞の失活が認められたので単層培養を行うことにしたため、実験の進みが遅くなり試薬の購入が遅れてしまった。また、1.5ml遠心チューブ用の高速遠心機が故障したため購入する金額約600000円を残していましたが、代替の遠心機を譲り受けたため購入しなくてよくなったので繰り越し金が生じました。