2018 Fiscal Year Research-status Report
Enamel matrix proteinの歯髄損傷治癒と再生への可能性を探る
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17K11714
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| Research Institution | Meikai University |
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Principal Investigator |
中村 裕子 明海大学, 歯学部, 講師 (50265360)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森 一将 明海大学, 歯学部, 准教授 (80372902)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Enamel Matrix Protein / 新生血管誘導 / VEGF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エナメルマトリックスタンパク質 （Emdgain(R)Gel (EMD)）の生物学的活性作用を歯髄創傷治癒や歯髄再生治療に応用することを目的に検討し、歯髄－象牙 質複合体への臨床活用を確立させることにある。EMDの血管新生に対する効果および組織誘導効果を臨床的に検討した。
１）歯髄再生を想定した場合における、根尖部の内径の大きさが血管やそれに伴う組織の誘導に影響を与えるか、EMDを用いることによる効果の有無を検討した。２）上記の結果から根尖部の大きさを企画したヒト抜去歯を用い、根管内にEMDを 填入した試料をラット背部に静置した。４週間後に摘出し、根管内への組織誘導や根管壁面に接着する組織の様相を観察し、PLGと比較することによりEMDの効果 を検討した。３）ヒト歯髄細胞、歯根膜細胞および歯肉繊維芽細胞の細胞増殖、走化性、遊走性および石灰化形成能（ALP活性、アルザリン染色）に対するEMD の効果をｂFGFと比較して検討した。
結果：EMDは、ヒト抜去歯の根管内への血管誘導能や組織誘導を亢進することが認められ、さらに根管壁面に対する細胞の接着性を高めている可能性があっ た。EMDを塗布した根管壁面では、象牙質に密着した様相で、血管を含んだ繊維性の組織が観察された。また、ヒト細胞を用いた検討では、歯髄細胞に対して、EMDは bFGF同様に細胞遊走能や走化性を亢進することが認められた。一方で、石灰化物形成に関しては、ｂFGFよりも高い活性を認めたが使用する細胞により異なることが示唆された。１，２）の結果を平成２９年 日本歯科保存学会秋季大会にて報告し、３）について３０年日本歯内療法学会にて報告した。
その後、EMDの歯髄細胞の血管内皮細胞への分化ならびに異なる細胞への活性の違いについてなどの検討を行った。近く、報告予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
理由 実験計画として、以下の項目で研究予定を計画していた。 1. EMD の投与濃度、時間（期間）によるヒト歯髄細胞および歯髄幹細胞に対する細胞増殖能および毒性の有無を検索するため、ミトコンドリアの酵素活性を利 用したMTT assay を行い、 相対的生細胞数を測定する。 また、Migration assay に関しては、Boyden chamber を用い、移動した細胞数を計測することで、 EMD による細胞遊走への影響を検索した。さらにシャーレ内の細胞の走行性への影響も併せて検討を行った。これらの計画に対して、歯髄細胞のほか、歯根膜細胞 を比較対象としたが、概ね計画通りに実行することができた。 2. ヒト歯髄細胞の分化に対する影響は、培養細胞に対しEMD を投与した培養細胞の分化度を石灰化形成の誘導活性に関して検討した。ALP assay アルザリンレッドを使用した色素沈着による石灰化誘導についての検討結果を行った。得られた結果をまとめ、学術大会にて報告を行った。 ３．ヒト血管内皮細胞におよぼす血管形成促進効果の検討は、正常ヒト皮膚繊維芽細胞と臍帯静脈血管内皮細胞（HMVECs)(KURABO)を用い、管腔形成の検討を 行っているが、形成の目視が確認できない場合、培養上清中の血管新生関連タンパク質をレベル測定し、比較することとしている。現在、検討中にある。一方、動物実験における歯髄細胞の再生系を検討しているが、実験系の難易度も高く、傾向が推察されるに留まっている。今後手技を含め、検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
EMDの細胞に対する効果を、歯髄細胞ならびに歯髄幹細胞を用いて検索する。主な項目は、血管新生効果、血管内皮細胞への分化への影響の有無を評価する。30年度の研究に続き、以下の項目を検討する。
1.ヒト血管内皮細胞におよぼす血管形成促進効果のメカニズムの検討細胞の分離および培養条件は、30年度と同様に行う。また、ヒト皮膚線維芽細胞および臍帯 静脈血管内皮細胞は、購入する。ヒト血管内皮細胞におよぼす血管形成促進効果の検討は、正常ヒト皮膚繊維芽細胞と臍帯静脈血管内皮細胞（HMVECs)(KURABO) を用い、培地上でEMDの管腔形成に対する影響を観察した。対象として VEGF（A）と Suramin 等の抑制試薬を用い比較することでメカニズムを検討したが、再現性の確認を予定する。2. LuminexR200 システムを用 いてEMDにより誘導されたヒト歯髄細胞の培養上清中の血管新生関連タンパク質をレベル測定する。3. 30年度に続き、動物実験は、Spraque-Dawley 系ラ ットを 用いた抜髄歯内への歯髄様組織の侵入や誘導の実施し、得られた組織の詳細な細胞像とそこから想定する機能についてさらに検討したいと考えている。また、手技の難易度を考慮し、実験方法の改良を検討する。4. EMDの歯髄細胞、歯髄幹細胞への増殖、遊走、石灰化促進に対しする影響を検討し、学会報告も行った。今後は、歯髄幹細胞の血管内皮細胞への分化誘導へのEMDの影響を検討するとともに、得られた血管内皮細胞の三次元培養における網目状構造の形成が得られるかについて検討を行う予定である。対象として、管腔形成を誘導する血管内皮細胞、誘導培地（EGM-2）を使用する。
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