2019 Fiscal Year Research-status Report
抗菌剤処理後のう蝕，歯周病モデルポリマイクロバイアルバイオフィルム群集構造の解析
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17K11721
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| Research Institution | Kanagawa Dental College |
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Principal Investigator |
富山 潔 神奈川歯科大学, 大学院歯学研究科, 准教授 (90237131)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
向井 義晴 神奈川歯科大学, 大学院歯学研究科, 教授 (40247317)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | バイオフィルム / 抗菌剤 / 緑茶 / タンニン / クロルヘキシジン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成31年度は，歯周病およびインプラント周囲炎バイオフィルムモデルの開発を行う予定であった．それと同時に歯周病およびインプラント周囲炎の治療に効果的な抗菌剤および抗菌療法の開発を目指したため，まずは以下の研究を行ない，良好な成績を得ることができた．バイオフィルム細菌叢に対するS-PRG溶出液やクロルヘキシジン処理の影響を分析した．ガラス円板上に形成した24時間培養PMバイオフィルムに対し30分間の各処理を行なった後，共焦点レーザー顕微鏡により生・死菌の分析およびバイオフィルム構造の分析を行なった（n＝10）（実験１）．また，バイオフィルム群集構造の網羅的分析を次世代シークエンサーにより行なった．（実験２）実験群は ① 脱イオン水処理群（cont），② 0.2 %グルコン酸クロルヘキシジン群（0.2C），③ S-PRG溶出液処理群（SPRG）の3群とした． [実験1]：使用済み培養液のpHは7.02から6.95の間で推移し中性環境を維持していた．LIVE/DEAD染色後のバイオフィルム中の全細菌細胞に対する死菌の割合は，cont群: 3.2 %，0.2C群: 81.5 %，SPRG群: 82.3 %であり，SPRG群は0.2C群と同等の死菌数の割合を示した．以上の結果からS-PRG溶出液による30分間処理は十分な抗菌効果を発揮できることがわかった．[実験2]：Veillonella disparおよびVeillonella tobetsuensisの割合が減少し, Streptococcus salivariusの割合には変化が認められなかった．Veillonella disparおよびVeillonella tobetsuensisは口臭の発生やプラークの初期形成に関与することが報告されており,歯周病及びインプラント周囲炎の抑制に寄与する可能性があると考えられる.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度は以下の実績を得ることができ，おおむね順調であるが，内容についての発表および論文作成に至っていない．成果は以下のとおりである．
バイオフィルムに対する緑茶カテキンの効果をAcademic Centre for Dentistry Amsterdam (ACTA) のバイオフィルムモデル（polymicrobial biofilm（PM）バイオフィルム）形成用モデルを使用して検討を行なった．成果を以下に報告する．
材料および方法）
ガラス試片上にポリマイクロバイアルバイオフィルムを作製した. 培養液にMcBain 2005（0.2%スクロース含有）を用い，連続嫌気培養を24日間行なった後，バイオフィルムに各薬液処理を施し（緑茶(G)，クロルヘキシジン(CH)，DW(Cont)），その後，48時間培養を行なった．
結果）[実験1]： GおよびCH群の処理直後における使用済培養液のpHは, バイオフィルムの病原性に関係なくcontに比較して有意に上昇し, その後48時間培養を継続すると, G群のpH下降は他群に比較し，有意に抑制された. 72時間の時点での全細菌細胞に対する死菌細胞の割合は，G群（70.8 %）はCH（62.5 %）群より有意に高かった． [実験2]：唾液A, B, およびC群において，GとContのバイオフィルム群集構造間には差が認められなかったが，CHと他群間には明瞭な差が認められた．また，GとContの構成菌はStreptococcus salivariusが主体であったが，CH群では，Haemophilus parainfluenzaeやStreptococcus anginosusの割合が増加していた．以上の結果から，緑茶は耐性菌などを増やさず，健全な細菌叢を維持しつつ，バイオフィルム形成を抑制できることが示された．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は歯周病およびインプラント周囲炎モデルの開発および検討してきた抗菌剤の効果を実際に開発したモデルを使用して検討する．具体的な方法は以下の通りである．
【目的】インプラント周囲炎に罹患した患者において,インプラント体表面の除染はインプラント体周囲の消炎や骨の再結合を得るために,きわめて重要である.しかし,この除染方法についてはいまだ確立していないのが現状である.そこで,インプラント体と同様の表面処理を施したチタン合金表面に付着した歯周病原性細菌の効果的な除菌方法をex vivoにおいて調べ,インプラント周囲炎に対する効果的な治療方法の基礎的検討をする目的で本実験を行なう.【実験材料および方法】試験片（各群 n = 6）は次の材料を使用する．（実験１）①インプラント体と同様の表面処理を施したチタン合金②象牙質試片③パラジウム合金．（実験２）①インプラント体と同様の表面処理を施したチタン合金②アクセスホール模倣チタン合金③象牙質試片④パラジウム合金．実験２では，アクセスホールに蓄積した細菌叢がインプラント周囲炎を発症させるとの報告に基づき，これを仮説として，検討する．バイオフィルムには、多菌種入りバイオフィルム（ACTA, オランダ）を用い，培養期間は96時間とする．抗菌剤には，柿抽出タンニン，緑茶抽出タンニン，0.2% および0.05% グルコン酸クロルヘキシジンそして銀イオン含有洗口液を用いる．評価方法は次の通りである．・次世代シークエンサーによる細菌叢の網羅的分析，・Streptococcus属の分析（Realtime qPCR, USA），・Fusobacterium属の分析（Realtime qPCR, USA），・Veillonella属の分析（Realtime qPCR, USA），・使用済み培養液のpH．統計分析は，サンプル間の比較解析を主成分分析により行う。
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| Causes of Carryover |
2019年度の研究目的は，歯周病およびインプラント周囲炎バイオフィルムモデルを開発し，それぞれの疾病に効果的な抗菌剤および耐性菌を作らない抗菌療法を検討することであった．効果的な抗菌剤を検討する研究に時間を費やして，いくつかの候補に絞ることができた（柿抽出タンニン，緑茶抽出タンニン，S-PRG溶出液，銀イオン含有う洗口液）．しかしながら，歯周病およびインプラント周囲炎バイオフィルムモデルの開発をするまでには至らなかったため，2020年度までの延長申請を行ない，ご承諾いただいた．今年度は上記のバイオフィルムモデルの開発およびインプラント体と同様の表面処理を施したチタン合金表面に付着した歯周病原性細菌の効果的な除菌方法をex vivoにおいて調べ,インプラント周囲炎に対する効果的な治療方法の基礎的検討をする目的で実験を行なう.分析法は次世代シークエンスによる細菌叢の分析，real-time PCR法による特定病原菌の分析，総細菌数の算定，使用済み培養液のpH測定を行なう．
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