2018 Fiscal Year Research-status Report
細胞外基質認識機構による歯周組織の恒常性維持メカニズムの解明
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17K11796
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
野崎 浩佑 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 助教 (00507767)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永井 亜希子 愛知学院大学, 歯学部, 准教授 (40360599)
堀内 尚紘 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 助教 (90598195) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 生体材料 / 再生医療 / 無機材料 / チタニア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
歯と歯槽骨を結合する歯根膜組織は，多種多様な細胞群を含む線維性結合組織であり，骨とセメント質の2つの硬組織に囲まれているにもかかわらず石灰化せず，その厚さが一定である生体内でも稀有な組織で，歯周組織の恒常性の維持を担う．歯科診療において近年，幅広く用いられているインプラント治療は，この歯根膜組織が存在しないため，インプラント体周囲の歯周組織のリモデリングが行われず，加齢等による生体反応への適応性が低い．また，天然歯において歯周組織は細菌感染に対するバリア機能を発揮するが，インプラントによる治療が細菌感染に対して抵抗性が低い原因も，歯周組織の欠損に由来する．酸化チタンがコーティングされたチタンインプラントは生体活性が高く，近年では，埋め込み型生体材料の第一選択の材料とされている．酸化チタンは，一般的な合成を行うと｛101｝面が約95%を占めるが，適切な阻害剤を用いることにより｛001｝面が露出した酸化チタンを合成することが可能となる．｛001｝面は｛101｝面と比較して，表面自由エネルギーが高いことから種々のイオンやたんぱく質が吸着しやすく，また，その光触媒作用が高いことが報告されている．本年度は，このような酸化チタンの合成を試み，その光触媒作用を評価した．光触媒作用の評価として，スーパーオキサイドおよびハイドロキシルラジカルの生成量を評価した．結晶面の制御には，フッ素を用い，出発原料にチタンブトキシドとヘキサフルオロチタン酸アンモニウムを用いた．合成した酸化チタンの結晶面は，出発原料のフッ素/チタン比により制御可能であり，その結晶サイズも制御可能となった．また，スーパーオキサイドおよびハイドロキシルラジカルは，結晶面の比率によりその活性が制御されることが明らかとなった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は， ヘキサフルオロチタン酸アンモニウムとチタンブトキシドを出発原料とし，水熱合成によりチタニアナノシートを作製した．フッ素とチタンの仕込み比を，1.0 ，1.2，1.5，1.，2.0とした．なお本研究では，対照群としてチタニアナノ粒子（STS-01，石原産業）を用いた．作製したチタニアナノシートは，フッ素/チタンの仕込み比の増加に伴い，結晶の厚みおよび長さが増加した．また｛001｝面と｛101｝，面の割合も増加したことから，本手法によりチタニアナノシートの高次構造制御が可能であることが示唆された．また，X線回折による結晶構造解析では，すべての試料がアナターゼ型チタニアに帰属するピークが認められた．次に，EDSにより元素分析を行ったところ，フッ素が検出された．X線スペクトルより，WPPD法による結晶構造の精密化を行ったところ，いずれの試料においてもa軸およびc軸の変化は認められず，フッ素の固溶は認められなかった．以上から，作製したチタニアナノシートの表面にフッ素イオンが吸着していることが示唆された．
次にチタニアナノシートの光触媒活性を評価する為に，活性酸素種であるハイドロキシルラジカルとスーパーオキサイドの評価を行った．定量用のプローブとしてそれぞれテレフタル酸二ナトリウムとニトロブルーテトラゾリウムを用い，水溶液中にチタニアナノシートを混和し，365nm，2.5kW/cm2，30分間光照射を行った．照射後，それぞれの蛍光量および吸光度を計測し，その光触媒活性を評価した．ハイドロキシルラジカルは，NS1.5が最も優れ，スーパーオキサイドはNS1.0が最も活性が高かった．このことは，光触媒作用による活性酸素種の発生は，面割合のみならず他の因子が関与していることが示唆された．以上よりおおむね順調に進展していると判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
階層性チタンインプラント材料の開発のため，作製したチタニアナノシートをコートしたインプラント材料の開発を行う．チタニアナノシートの結晶方位は，タンパク質やイオンなどの吸着量が異なることが報告されている．そこで，III型コラーゲンのチタニアナノシートへの吸着量の評価を行う．また，歯根膜線維芽細胞のセメント芽細胞・骨芽細胞へのパラクライン的作用を明らかにするために，セルカルチャーインサートに各コラーゲンおよび低分子化合物をコートし歯根膜線維芽細胞を播種する．また，細胞培養用ディッシュにはセメント芽細胞・骨芽細胞を播種し，共培養を行うことにより歯根膜線維芽細胞から分泌されたタンパク質の発現をELISA法にて検討を行う．また，細胞間相互作用の影響を明らかにするために，コーティングした試料に，歯根膜線維芽細胞を接着させる．接着完了後，細胞を含む試料を新しい細胞培養シャーレに移し，その周囲にセメント芽細胞・骨芽細胞を播種し，一定器官培養後，細胞間相互作用の検討を，タンパク・遺伝子レベルで検討する．特に，細胞間相互作用にかかわるカドヘリンを介したシグナリングカスケードを解析する．以上により最適化された試料を用いて，歯根膜組織およびセメント質・骨などの硬組織形成能を，実験動物を用いてインプラント体を埋入し組織学的に評価する．
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| Causes of Carryover |
未使用額が生じた理由は，実験動物より細胞を採取するのに十分な細胞数が得られたため，最小限の購入になったためである．また，既存の試薬を用いて試料の作製を行ったため，差額が生じた．未使用額と次年度使用額を併せて以下の項目に関して使用する予定である．①研究成果発表のための旅費（国内会議，国際会議）②試料作製に必要な薬品，消耗品の購入③細胞実験のための必要な薬品，消耗品，解析用試薬④動物実験のための必要な薬品，消耗品，解析用試料作製のための薬品，試料滅菌のためのガンマ線滅菌費用など．
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