2017 Fiscal Year Research-status Report
フォーカスド・プロテオーム解析による再生組織成熟シグナルの解明と再生医療への応用
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17K11826
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
上床 喜和子 東京大学, 医学部附属病院, 登録診療員 (20769583)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 夕子 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (50466744)
西條 英人 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (80372390)
星 和人 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (30344451)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 軟骨再生医療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現行の軟骨再生医療は、培養中に脱分化する軟骨細胞が、生体内に移植されると自然に成熟する過程を活用して行われているが、その分子メカニズムの詳細は不明である。本研究では、フォーカスド・プロテオーム解析を導入した網羅的かつ精緻な解析により、生体内における軟骨細胞の成熟促進因子を同定し、組織成熟シグナルを明らかにすることを目的としている。
１．In vivoおよびin vitroにおける軟骨細胞成熟過程の継時的評価 「生体へ移植された軟骨細胞（in vivo群）」および「基質誘導培地で培養された軟骨細胞（in vitro群）」の成熟過程について、継時的な比較検討を行った。軟骨細胞を増殖培地にて培養させた後（P0）、24 wellプレートにポリプロピレンプレートのカバースリップを静置し継代した（P1）。In vivo群については、培養７日後に軟骨細胞をカバースリップごとプレートから取り出し、ヌードマウスの腹腔内へ細胞面を腸に向けて移植した。In vitro群では、カバースリップ（P1）での培養７日後に増殖培地を吸引し、基質誘導培地で培養した。In vivo群、in vitro群ともに、トルイジンブルー染色、ヘマトキシリンエオジン染色で組織学的に軟骨細胞の成熟過程を評価した。real-time RT-PCRにより遺伝子発現を検討した。
2. 軟骨細胞の成熟過程に関わる因子の網羅的検索 第1項に準じてカバースリップへ播種した軟骨細胞を準備し、ヌードマウスの腹腔内へ移植、あるいは基質誘導培地で培養した。移植後１週および２週でカバースリップを回収し、M-PERによりタンパクを抽出した。今後、それぞれの細胞抽出液全体を二次元電気泳動にかけ、スポットの差を比較検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通り、in vivoとin vitroの軟骨細胞の評価を行い、網羅的な解析を行うためのサンプル採取を行っているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
2. 軟骨細胞の成熟過程に関わる因子の網羅的検索 細胞抽出液全体を二次元電気泳動にかけ、スポットの差を比較検討する。質量分析によるタンパク同定を行い、両群の比較からin vivo群特異的に発現し、組織構築に関与していると推察される候補分子を模索する。
3. 組織成熟シグナル伝達機構の解明と促進因子の選定 第1項に準じて、マウス腹腔へ移植した軟骨細胞からタンパクを抽出する。上記で選定した候補分子の継時的な発現変化を検証する。カバースリップ上の軟骨細胞について、候補分子の免疫組織化学染色を行い、軟骨成熟過程に伴う候補因子の局在変化を観察する。生体内における軟骨細胞の組織成熟誘導との関連が示唆される因子を選定する。
4. 選定因子の軟骨成熟促進効果の検証 選定した因子について、培養軟骨細胞での軟骨成熟促進効果を検証する。選定因子の恒常活性型あるいは抑制型遺伝子をクローニングし、レンチウイルスにそれぞれの遺伝子を組み、ヒト耳介軟骨細胞に導入する。カバースリップに播種し、DMEM/F12および組織成熟誘導培地にて培養する。組織学的観察、免疫組織化学的観察、遺伝子発現、生化学的定量を行う。
5. 軟骨成熟促進因子を活用した培養法の確立 検証された軟骨成熟促進因子が液性因子である場合は、軟骨細胞を培養する際に、培地中へ種々の濃度で添加し、in vitroで培養軟骨細胞の組織成熟を誘導する。関与するシグナル経路の全容が明らかになっている場合には、そのリガンドやシグナル伝達関連化合物により刺激し、その効果を検証する。In vitroで軟骨組織形成を促進する培養法を検討する。
6. 軟骨再生医療への応用 前項で確立した培養法により、軟骨としての組織形状と十分な強度を有する再生軟骨をin vitroで作製し、それを移植することにより軟骨再生医療への応用を検討する。
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| Causes of Carryover |
条件検討が比較的スムースに進んだため、試薬や物品の節約をすることができた。また、業者のキャンペーンなどを利用し、予定より安価に購入することができた。
来年度以降、候補因子を選定して検証を行っていく予定であるが、選定因子を絞りすぎず、幅をもたせた検討を行っていく予定にしている。
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