2017 Fiscal Year Research-status Report
口腔粘膜における核酸認識と抗菌ペプチドによる新規応答調節機構の解明
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17K11840
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
太田 耕司 広島大学, 病院(歯), 助教 (20335681)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武知 正晃 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 准教授 (00304535)
重石 英生 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 講師 (90397943)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 口腔粘膜上皮 / 核酸認識機構 / 抗菌ペプチドLL-37 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年，組織破壊によって放出される自己核酸が核酸受容体を介して炎症応答を誘導し，皮膚炎，肝炎が増悪することが報告されている。申請者らの予備実験において口腔粘膜上皮細胞の自己壊死画分を同細胞に添加するとT細胞遊走因子が誘導されること，また自己壊死画分のDNA分解酵素処理によってその誘導が抑制される結果を得ている。この結果は，口腔粘膜が非自己だけでなく自己核酸認識機能をもつことを示唆している。口腔粘膜における自己DNA認識機構の存在は報告がない。さらに申請者らは口腔粘膜炎症性疾患でみられるTNF-alphaがDNA認識受容体を活性化することで，免疫応答を増強することや，扁平苔癬組織中にDNA認識受容体が過剰に発現していることを予備実験で発見している。核酸認識受容体の活性化は核酸依存性応答を増強し，粘膜炎症を増悪し得ることを示唆している。しかしながら口腔粘膜における自己，非自己核酸認識応答機構と炎症性粘膜疾患の関与は明らかにされていない。
LL-37は，細菌感染により好中球から発現される抗菌ペプチドである。興味深いことに申請者らは予備実験で口腔粘膜上皮細胞にLL-37と細菌 DNAを同時添加するとDNAが細胞内に導入されることを発見した。この結果はLL-37が自己，非自己DNAを細胞内に導入し，細胞内受容体の認識を可能にする一方で，応答を選択的に調節している可能性を示唆している。口腔粘膜におけるLL-37 の核酸認識応答の調節については報告がない。
今回の計画は口腔粘膜細胞における自己，非自己核酸認識機構の解明と抗菌ペプチドによる核酸認識機構への新規作用，口腔粘膜炎症性疾患の関与を明らかにし，口腔粘膜疾患の新しい治療，検査法を検討することである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
不死化口腔粘膜上皮細胞（RT7）に自己壊死画分やmimic RNA，DNAであるPoly(I:C)，Poly(dA:dT)を単独添加，あるいはLL-37を同時添加した際のT細胞活性化因子であるCXCL10 mRNA発現をReal-time PCR法にて検討した．LL-37とPoly(I:C)，Poly(dA:dT)の親和性を核酸binding assayにて検討した．LL-37添加による核酸の細胞内導入の影響をFACSおよび蛍光免疫染色にて解析した．
これらの結果からLL-37 は自己壊死画分，Poly(I:C)，Poly(dA:dT)で誘導されるCXCL10の発現を増加した．特にPoly(I:C)誘導性CXCL10の発現誘導を著しく増加した。LL-37はPoly(I:C)，Poly(dA:dT)と親和性を持つことが示された。核酸とLL-37の前処理によって細胞質内へ核酸が導入されることが示された．
今回の結果から，LL-37は細胞壊死などで放出される核酸を細胞内に導入することによって口腔粘膜の炎症応答を増加している可能性が示唆された．
今回の成果の一部を第54回日本口腔組織培養学会(11月4日, 2017 年,岩手)などで発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は，核酸受容体特異的si RNA を用いて受容体欠損細胞を作製し，前述の核酸認識受容体依存性の遺伝子発現や，核酸認識依存性標的蛋白活性の影響をReal-time PCR 法，ELISA法，Western blotting 法にて検討する。受容体阻害による遺伝子の変化が認められなかった際には，DNA結合させた磁気ビーズを作製し， RT7全蛋白抽出画分からプルダウンした蛋白をSDS-PAGE 電気泳動，ゲル染色からTOF MAS 解析を行い，DNA結合蛋白の解析を行う。細胞抽出蛋白から核酸結合ビーズによるプルダウンassay を行い，同定した受容体とDNAの親和性を検討する。さらに核酸認識に関与する受容体に対する炎症性サイトカインの影響を検討するため，炎症性サイトカインによる核酸処理後の受容体の発現や，細胞内局在をWestern blotting 法，蛍光免疫法によって検討する。
口腔粘膜組織中の核酸，LL-37,核酸認識受容体と扁平苔癬等、口腔粘膜炎症疾患との関与を検討するために，広島大学大学院医歯薬学総合研究科倫理委員会による承認の下で，当科にて切除し，患者に同意が得られた口腔粘膜炎症性疾患の試料から，免疫組織染色を行い，組織中の外来性核酸，同定した核酸認識受容体，LL-37 の発現と局在を健常組織と比較を行う。
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| Causes of Carryover |
今回、試薬などの購入物品の一部が予定金額に下回った。
消耗品の購入などとして使わせていただく予定である。
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