口腔がん微小環境内のがん幹細胞と腫瘍関連マクロファージの機能解析と新たな治療戦略

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K11854
• Research Institution: The Nippon Dental University
• Principal Investigator: 里見 貴史 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (70276921)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河野 通秀 東京医科大学, 医学部, 助教 (00421066) ; 古賀 陽子 東京医科大学, 医学部, 准教授 (10392408) ; 近津 大地 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (30343122) ; 渡辺 正人 東京医科大学, 医学部, 臨床講師 (40349460) ; 長谷川 温 東京医科大学, 医学部, 助教 (50424619) ; 長尾 俊孝 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (90276709)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 口腔がん / がん幹細胞 / 腫瘍関連マクロファージ

Outline of Annual Research Achievements

腫瘍組織再現能をもち抗癌剤や放射線への抵抗性を有し、再発・転移の最大原因と考えられているがん幹細胞(Cancer stem cell: CSC)に注目した新たな口腔癌に対する治療法の開発を目指した研究である。
CSCは「静止期」に細胞増殖をほとんど行っていない。そのため、従来の癌細胞の増殖抑制を目的とした治療では、静止期に維持されているCSCには効果を発揮できない。従って、CSCを静止期から増殖期に移行させる治療の開発が直近の課題となっている。本研究は、口腔癌微小環境内におけるCSCとCSCを静止期から増殖期に移行させる重要な鍵を握ると思われる腫瘍関連マクロファージ(Tumor associated macrophage: TAM)との相互作用を解析する。さらに、CSCにおけるPI3K/Akt/mTOR経路とTAMにおける活性経路の双方からアプローチし、治療抵抗性を示す口腔癌に対する新たな治療法の開発を目指している。
マウス由来の扁平上皮癌株（SCCⅦ）およびヒト由来リンパ節転移口腔扁平上皮癌(Oral squamous cell carcinoma: OSCC)細胞株（HSC-3）とリンパ節非転移OSCC細胞株（HSC-2）を用いたIn vitro実験でスフェロイド形成能を持ったCD44発現CSCを用いて、液性因子(IL-6, MFG-E8)やmTOR阻害剤(Rapamycin)によるCSC activation抑制効果を解析する。さらにIn vivoで口腔癌浸潤モデルマウスの作製に成功し、CSCに対する治療として、CSF-1/CSF-1Rシグナルをターゲットに、CSF-1R阻害剤(PLX3397)を用いてTAM活性を抑制した効果とPI3K/Akt/mTOR経路をmTOR阻害剤(Rapamycin)で直接抑制した効果について比較検討を行う。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

マウス由来の扁平上皮癌株（SCC7）およびヒト由来リンパ節転移口腔扁平上皮癌(Oral squamous cell carcinoma: OSCC)細胞株（HSC-3）とリンパ節非転移OSCC細胞株（HSC-2）を用いたIn vitroでスフェロイド形成能を持つCSCの分離培養実験を行った。SCC7細胞株,HSC-3細胞株, HSC-2細胞株とも、酵素処理して細胞解離剤Accutaseで単一細胞化した口腔がん細胞を作製し、CD44に対する抗体で染色後、フローサイトメーター(FACS)を用いてCD44陽性腫瘍細胞とCD44陰性腫瘍細胞を分取し、スフェロイド形成能CD44発現細胞に対してWestern blot法およびreal-time PCRを用いて、幹細胞に特有な遺伝子発現、血清添加培地でCD44陰性の上皮性腫瘍細胞への分化能を検討した。
一方In vivoでは、マウス由来の扁平上皮癌株（SCC7）を2×107/mlに調整し、C3Hマウスの口腔内(舌、歯肉)もしくは咬筋内に50μl注入し、口腔癌浸潤モデルマウスの作製に成功し、CSCに対する治療として、CSF-1/CSF-1Rシグナルをターゲットに、CSF-1R阻害剤(PLX3397)を用いてTAM活性を抑制した効果とPI3K/Akt/mTOR経路をmTOR阻害剤(Rapamycin)で直接抑制した効果について比較検討を行っている。

Strategy for Future Research Activity

マウス由来の扁平上皮癌株（SCC7）を2×107/mlに調整し、C3Hマウス咬筋内に50μl注入し、口腔癌浸潤モデルマウスを作製し、また、高リンパ節転移OSCC細胞株であるHSC-3を2×107/mlに調整し、無胸腺マウスの口腔内(舌、歯肉)もしくは咬筋内に50μl注入し、口腔癌リンパ節転移モデルマウスを作製する。CSCに対する治療として、CSF-1/CSF-1Rシグナルをターゲットに、CSF-1R阻害剤(PLX3397)を用いてTAM活性を抑制した効果とPI3K/Akt/mTOR経路をmTOR阻害剤(Rapamycin)で直接抑制した効果について比較検討する。実験は、マウス由来の扁平上皮癌株（SCC7）の口腔癌浸潤モデルマウスと口腔癌リンパ節転移モデルマウスをそれぞれコントロール群、CSF-1R阻害剤投与群、mTOR阻害剤投与群の３群、計６群に分類して、抗腫瘍効果、リンパ節転移抑制効果、CSC activation抑制効果と予後（生存日数）について比較検討を行う。また、CSF-1R阻害剤(PLX3397)、mTOR阻害剤(Rapamycin)によるTAM発現の解析については、F4/80およびCD163,CD204,CSF-1R(CD115)の発現を免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法を用いて行う。mTOR阻害剤投与群、CSF-1R阻害剤投与群、コントロール群の３群でTAM局在や発現強度について比較検討する。また、腫瘍微小環境内におけるVEGF-C,COX-2,NF-κB,CSF-1,TNF,IL-6, MFG-E8,CD44,CD133の発現について免疫組織化学染色法およびin situ hybridization法を用いて比較検討を行う。

Causes of Carryover

平成30年4月に東京医科大学口腔外科学分野から日本歯科大学生命歯学部口腔外科学講座へ異動したことで研究環境が大きく変わり、その整備に時間を要した。そのため、平成30年度の研究経費の大部分は令和元年度に繰り越し、大幅に遅れた平成30年度の研究計画を令和元年度に行った。このような理由で大幅に遅れた研究計画であるため１年の研究延長を申請した。本来昨年度に計上していたIn vivo実験における実験動物の購入費用や免疫組織化学染色における試薬（抗体等）およびin situ hybridization法にかかる費用等を次年度に繰り越して使用する。