2017 Fiscal Year Research-status Report
癌関連マクロファージを介した血管新生因子CCN2のリンパ管新生制御機構の解明
| Project/Area Number |
17K11866
|
|---|
| Research Institution | Fukuoka University |
|---|
Principal Investigator |
近藤 誠二 福岡大学, 医学部, 准教授 (10432634)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小玉 正太 福岡大学, 医学部, 教授 (90549338)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | リンパ管新生 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
近年、癌微小環境において、癌細胞自身が発現するサイトカインやケモカインのみならず、癌間質に浸潤・集積してくる炎症細胞、免疫担当細胞などの支持細胞が発現している様々なサイトカインが、癌の浸潤・転移に不可欠なリンパ管新生に重要な役割果たしていることが明らかになってきた。この知見をもとに、腫瘍血管新生因子CCN2が支持細胞の１つである癌関連マクロファージ(tumor-associated macrophage; TAM)から産生され、リンパ管内皮細胞で発現している転写因子prox-1を始めとして、リンパ管マーカーであるpodoplanin、LYVE-1の発現誘導を介して、リンパ管新生を主導的に制御しているか明らかにするため、リンパ管新生制御因子としてのCCN2の分子的背景・機構の解明する。
現在、悪性黒色腫細胞株におけるCCN2の細胞内局在による発現解析と悪性黒色腫細胞移植モデルによるリンパ管新生関連遺伝子の組織学的検索を行なっている。具体的にはATCC配給B16-F1(低転移性)および-10(高転移性)の2種類のマウス皮膚悪性黒色腫細胞株を用い、リンパ管新生に関与が知られているVEGF-C、-Dはもとより、CCN2、その上流制御因子TGFβの発現について、高、低転移性の細胞特異性により発現差異があるかどうか、polymerase chain reaction (PCR)法およびイムノブロット法にてmRNAレベルおよびタンパクレベルにて解析している。組織学的検索については、C57BL/6Jマウスを使用した高転移性、低転移性悪性黒色腫細胞移植モデルによるリンパ管新生関連発現サイトカインの組織学的検索を行なう。Luminexによる網羅的解析時に判明した時間的至適条件下での組織(皮下腫瘍塊、腋窩リンパ節、肺組織)回収はもとより、移植早期段階の組織も回収しておき、免疫組織学的解析を行なっている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
悪性黒色腫細胞株におけるCCN2の細胞内局在による発現解析は問題なく進んでいるが、悪性黒色腫細胞移植モデルによるリンパ管新生関連遺伝子の組織学的検索について移植細胞数の至適条件設定に遅延が見られ、皮下腫瘍塊、腋窩リンパ節、肺組織への転移状況が一定しない結果がある。また、標的分子はCCN2、その上流制御因子Transforming growth factor (TGF)-βであるが、リンパ管新生因子VEGF-C、-D、さらにはリンパ管内皮細胞で発現している転写因子prox-1と同じくリンパ管マーカーであるpodoplanin, リンパ管壁内宮表面に発現するLYVE-1の発現を検討予定していた。また、癌微小環境における癌周囲支持細胞であるTAMの同定にはCD11bをマーカーとして用いる予定であった。これらの同定のための抗体力価が一定せず、さらに再現性のない結果が出る場合もあることから、抗体の変更や様々な条件を設定している段階である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
上記遅延を解消した後、支持細胞におけるCCN2添加によるリンパ管新生因子発現変化の確認や支持細胞におけるCCN2分子強制発現もしくは、発現抑制による機能解析を行なっていきたい。マウス初代培養リンパ管内皮細胞を使用してCCN2分子強制発現によるリンパ管新生因子発現変化の確認を行なう。リポフェクション法でpcDNA3.1 ccn2を遺伝子導入し、prox-1をはじめとするリンパ管新生因子発関連遺伝子の活性化が起こるか否か検討する。さらに他の支持細胞であるマクロファージでも検討するために、マウス初代培養マクロファージに同様のリポフェクション法でccn2遺伝子導入を行い、その発現動態の比較検討、細胞特異的現象の有無を確認する。同じく上記細胞を利用してccn2分子のknockdownによる表現系を検討する。検討事項はprox-1、podoplanin、LYVE-1の活性化がみられるか検討する。
|
| Causes of Carryover |
至適条件設定に時間がかかり、物品費、旅費の消費が予定通り進まなかった。問題は解決されつつあり、データの集積が進行しつつあるので、今後、物品費と成果発表のための旅費など経費がかかる予定である。
|
