2018 Fiscal Year Research-status Report
口腔癌浸潤先端部微小環境での腫瘍免疫抑制機構の解明
| Project/Area Number |
17K11869
|
|---|
| Research Institution | Kanazawa University |
|---|
Principal Investigator |
中村 博幸 金沢大学, 医学系, 准教授 (30542253)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北原 寛子 金沢大学, 附属病院, 医員 (70507053)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 口腔癌 / PD-L1 / MMP |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
MMPとPD-L1を安定発現するHEK293細胞の培養上清中に含まれる、細胞膜から切断されて遊離したPD-L1を、Western blot法にて調べる。空ベクターを導入したHEK293細胞と比較し、PD-L1の遊離が亢進しているMMP安定発現株を調べ、PD-L1切断活性をもつMMPを特定した。さらに、PD-L1のタンパク発現ベクターのみ導入したHEK293細胞にリコンビナントMMPを添加し固定したのち、フローサイトメーターで解析し、細胞表面のPD-L1が減少した細胞を調べ、PD-L1切断活性をもつMMPを特定した。さらに、膜結合部位を欠失し、C末端に6xHisタグを付加した分泌型PD-L1の発現ベクターを作製した。HEK293細胞にこのPD-L1発現ベクターを導入し安定発現株を作製した。分泌されたPD-L1はHisタグカラムで精製した。精製したPD-L1を活性化T細胞培養液に添加し、フローサイトメーターを用いてT細胞でアポトーシスが誘導されることを確認した。さらに、CD3+T細胞をヒト末梢血からDynabeadsを用いてポジティブ単離した。分離したT細胞をPHAで処理し活性化T細胞を得た。さらに、PD-L1発現HEK293細胞を30Grayで放射線処理し、細胞表面のPD-L1タンパクに影響を与えることなく、細胞増殖を抑制する。この細胞にリコンビナントMMPを添加し24時間培養した後、活性化T細胞を加え共培養する。その後フローサイトメーターでAnnexin+/DAPI－細胞を測定し初期アポトーシスを起こしたT細胞を測定した。MMP処理によるアポトーシスT細胞の減少を調べ、PD-L1の分解によりT細胞の免疫寛容を抑制するMMPを特定した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大幅な遅延なく進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
まず、臨床治験で使用された合成MMPインヒビターをマウス口腔癌浸潤転移モデルに投与し、臨床治験で観察された癌の悪性度の亢進を確認する。PD-L1タンパクの分解による増減を免疫染色、Western blot法、ELISA法にて調べる。合成MMPインヒビター投与によりPD-L1の分解が抑制され4D型高浸潤口腔癌が誘導されるかを検討する。さらに、ここまでの実験で明らかになったPD-L1の分解活性をもつMMPの発現ベクターを、4D型高浸潤口腔癌細胞であるHOC313細胞に遺伝子導入し、MMP安定発現高浸潤口腔癌細胞を作製する。この細胞を免疫不全マウスの口腔底に同所移植し、移植癌細胞の浸潤様式を病理切片で、頚部リンパ節転移を造影剤を用いたマイクロCTを用いて観察する。MMP発現により癌組織中のPD-L1が分解され、腫瘍免疫が活性化されることにより高浸潤癌細胞が死滅し、浸潤様式が高浸潤から低浸潤へと変化するかを観察する。以前複数の製薬会社が臨床治験の際作製した合成MMPインヒビターのうち、本研究で特定したPD-L1を分解し免疫寛容を抑制するMMPの働きを妨げることなく、癌細胞の浸潤転移で組織破壊に関わる他のMMPを選択的に阻害するものを検索する。この選択的MMPインヒビターをマウス口腔癌浸潤転移モデルに投与し、腫瘍抑制効果を観察する。さらに、ニボルマブとこの選択的MMPインヒビターの併用で腫瘍抑制効果が亢進されるかを検討する。また、腫瘍の病理切片を作製し、浸潤様式が高浸潤から低浸潤へと変化しているかを観察する。
|
| Causes of Carryover |
購入予定消耗品の購入残金が不足したため次年度の予算と合わせて購入するため
|
