Analysis of cancer immune response to lymph node metastasis mechanism in oral squamous cell carcinoma

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K11876
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 熊丸 渉 九州大学, 大学病院, 講師 (90432947)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鬼丸 満穂 九州大学, 医学研究院, 助教 (00380626)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: シングルセル樹立法 / 口腔扁平上皮癌細胞株 / がんの不均一性・多様性

Outline of Annual Research Achievements

これまでに口腔癌細胞株WK2（70継代）でのヌードマウスの舌への異種移植では、造腫瘍能が30%（3/10頭）頸部リンパ節への転移能が33%（1/3頭）であり、また、同一患者の後発転移巣から樹立したWK3F癌細胞株では、造腫瘍能が50%（5/10匹）、頸部リンパ節への転移能が60%（3/5匹）であったことが確認されている。
がんの不均一性・多様性に対応しうる免疫応答の解明には、さまざまなシングルセルの樹立は重要と考えられる。口腔扁平上皮癌細胞株（WK2）の初代培養より早期に保存された癌細胞より新しい方法でシングルセルの樹立を試みた。これまでの 1)通常の限界希釈法 2)シングルセル分注・培養プレートSmart Aliquotorを用いて方法では、辺縁からの増殖を厳密に除外するのが難しかった。そこで、24穴プレートの中央に1cell/50μlで滴下し、底面接着後にメディウムを加え、中央部の写真をキーエンスBZ-X810 で定期的に撮影しながら、シングルセル由来であることを証明して、増殖したものをシングルセルとした。
480wellに播いた中で、シングルセル由来の99ｗellの中から、安定した増殖を認めた10cellについて、MTT assay による増殖能、Sphere Forming Assay による浮遊培養下での自己複製能を調べた。JMP16.0による解析で、閾値の設定によるが、2～8群に分けられた。最大8種類のクローンの抽出に成功した。
今後は、形態学的（基底細胞様細胞、角化細胞様細胞、紡錘形様細胞）な違いやヌードマウスの舌への移植による転移能およびマイクロアレイでの遺伝子解析により、性格の異なるクローンの選別を行い、同一患者のリンパ球との反応を確認する予定である。