2017 Fiscal Year Research-status Report

フィトケミカルによる気管上皮安定化と気管支喘息調節機構

Research Project

Project/Area Number	17K11899
Research Institution	Tokyo Medical and Dental University
Principal Investigator	脇田亮東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (60376712)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	船山ひろみ鶴見大学, 歯学部, 助教 (00359530)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	気管支喘息 / フィトケミカル / カルシウムチャネル
Outline of Annual Research Achievements	研究者らは気管支喘息発作の機序の一つとして、気管支平滑筋の調節機構に注目している。また、その調節作用に影響を及ぼすものとして漢方生薬由来物質に注目し、気管支平滑筋調節機構の解明を目指してきた。今回我々は苦参に由来する数種のフィトケミカルを用い、気管支平滑筋の直接的調節機構および、気管上皮に対する調節機構（安定化作用）、さらに上皮由来のメッセンジャーを介した間接的な平滑筋調節機構の解明を目指した。先行研究で、漢方生薬成分の一つであるTrifolrhizinやGingerolにはPKAの活性化やPLCbの抑制による平滑筋収縮抑制効果がみられた。そこで今回研究対象としたフィトケミカル（kushenol, maaackian, sophoraflavanone G）の上記経路への影響を観察するため、myosin light chainのリン酸化（pMLCの発現）を指標とした収縮抑制効果を検討するとともに、CREBやCPI-17をターゲットとして細胞内情報伝達経路を検討することとした。その前段階として、気管支平滑筋の初代培養細胞を用いたKushenのMLCのリン酸化経路への影響を確認し効果濃度を検討中である。一方気管上皮の初代培養細胞を用いた生薬由来成分の前処理の影響に関して、培養上清とPGE2単体の気管支平滑筋細胞への作用の比較において共に気管支収縮抑制効果がみられる場合があり、現在上清中のPGs発現をEIA法で検出するとともにその詳細を検討している。また研究分担者により、上皮細胞のヒスタミン受容体・ムチン産生能変化をRT-qPCR法にて検討中である。さらに平滑筋細胞の持続的収縮機構に関連し細胞内カルシウムイオン（Ca2+）濃度調節に重要な役割を果たしている筋小胞体内のカルシウム濃度変化を観察するため、新規蛍光プローブの選択と条件設定を行なっている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 筋収縮発現に影響する細胞内あるいは小胞体内カルシウム濃度［Ca2+］iの変化を計測するため蛍光プローブが必要となる。また本研究に用いる気管支平滑筋の初代培養細胞はを継代する際にEGF, FGF, ITSといった成長因子を添加していた。本年度内にこれらを保管していた超低温フリーザーが故障したため、継続的細胞培養および［Ca2+］i測定ができなくなった。設備の問題は年度内に購入することで解決したが、新規購入した試薬で継代された細胞が以前の研究で用いた細胞と同様の特性を有するかの検証、また蛍光プローブに対する反応性の確認を行う必要が生じたために、研究の遅延が生じたがこれらの再確認はすでに終了しており、それ以降は予定通りの培養・測定が可能となっている。
Strategy for Future Research Activity	上記の遅延に対しては、所属施設の共用設備であるスクリーニングシステムを用い、多数のフィトケミカルに対し、同時に［Ca2+］i測定を行うことで研究期間の短縮を図り対応することとする。29年度の結果より気管上皮からPGE2あるいは類似物質の分泌が予測されるため、cAMPを介したPKA産生による気管支収縮抑制作用に注目し、その検証をおこなうと共に、PGs に対する細胞膜受容体を遮断することによる効果減弱を確認する。また本学附属施設の化合物ライブラリを利用し、複数のフィトケミカルに対する平滑筋反応の半数効果濃度を測定し、併用による相互作用のある組み合わせを効率的に検出する。
Causes of Carryover	（理由）超低温フリーザーの故障により、継続的細胞培養および培養細胞を用いた［Ca2+］i測定が行えなかったため、研究の遂行が一時中断、遅延した。そのため培養・測定に必要な実験機材・試薬購入の費用が生じなかった。またフリーザー購入等の費用は別途設備費より捻出できたため想定外の支出も生じなかった。（次年度計画）気管支平滑筋培養細胞や気管上皮培養細胞を用いて、Ca2+i変化をCa2+プローブとスクリーニングシステムを用い測定する。また実際の収縮変化を検証するためpMLCをWestern Blotにより確認する。フィトケミカルの気管支収縮抑制には気管上皮からのPGs 分泌が予測されるため、アデニルシクラーゼの抑制やEP2/4受容体の遮断による平滑筋収縮能変化を観察する。可能であればwild typeマウス摘出気管支を用いて気管上皮の有無やPGsの添加による影響をアセチルコリン刺激に対する収縮抑制効果を指標として比較検討する。