2018 Fiscal Year Research-status Report
フィトケミカルによる気管上皮安定化と気管支喘息調節機構
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17K11899
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Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
Principal Investigator |
脇田 亮 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (60376712)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
船山 ひろみ 鶴見大学, 歯学部, 助教 (00359530)
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Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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Keywords | 気管支喘息 / フィトケミカル / カルシウムチャネル |
Outline of Annual Research Achievements |
研究者らは気管支喘息発作の機序の一つとして、気管支平滑筋細胞の cAMP を介した調節機構に注目している。また、その調節作用に影響を及ぼすものとして漢方生薬由来物質に注目し、気管支平滑筋調節機構の解明を目指してきた。今回我々は苦参に由来する数種のフィトケミカルを用い、気管支平滑筋の直接的調節機構および、気管上皮に対する調節機構(安定化作用)、さらに上皮由来のメッセンジャーを介した間接的な平滑筋調節機構の解明を目指した。 先行研究で、漢方生薬成分にはPKAの活性化やPLCbの抑制によると考えられる平滑筋収縮抑制効果がみられた。そこでフィトケミカルの上記経路への影響を観察するため、myosin light chainのリン酸化(pMLCの発現)を指標とした収縮抑制効果を検討するとともに、CREBやCPI-17をターゲットとして細胞内情報伝達経路を検討することとした。その前段階として、気管支平滑筋培養細胞を用いたKushen抽出物のcAMPシグナル伝達系を介したMLCのリン酸化経路への影響を確認し効果濃度を検討中である。また研究分担者により、上皮細胞のムチン産生能変化をRT-qPCR法にて検討中である。一方生体内への薬物取り込み法として変動電場を用いたイオントフォレーシスの有用性検討に関しても研究を進め、高い極性のため経皮吸収が極めて困難なビスホスホネートの体内への吸収と効果部位への作用を確認することで、同手法の有効性を確認できた。さらに平滑筋細胞の持続的収縮機構に関連し細胞内カルシウムイオン(Ca2+)濃度調節に重要な役割を果たしている筋小胞体内のカルシウム濃度変化を観察するため、新規蛍光プローブの選択と条件設定を行なっている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
筋収縮発現に影響する細胞内カルシウムイオン測定あるいは小胞体内カルシウム濃度計測が可能な蛍光プローブの反応性の確認はほぼ終了している。Trifolirhizinによるカルシウム増強の抑制が再現できておらず、またハイスループットアッセイが可能であった測定装置(所属施設の共用設備)での故障により研究が遅延している。現在代替として蛍光顕微鏡による測定法を確立すべく検討中である。それ以前の測定で、これまで研究に用いてきた海外の研究協力者の所属する研究班により単離・提供されたTrifolirhizinと新規購入した同名試薬の反応に差が見られた。現在詳細を確認し、Trifolirhizinの抽出法を見直すとともに類似した分子量と物性を有するフィトケミカルを探索し、測定を行う予定である。培養関連設備の問題はほぼ解決したが、新たな測定法を併用する必要もあり反応性の再確認を行う必要が生じたために、研究の遅延が生じているがそれ以降は予定通りの培養・測定が可能となっている。
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Strategy for Future Research Activity |
進捗状況の改善策としては、複数のフィトケミカルに対して[Ca2+]i測定を同時に行うことで期間の短縮を図る。前年度結果より気管上皮細胞により産生されたPGs等がメディエーターとして機能していると考え、cAMPを介したPKA産生による気管支収縮抑制作用に注目しその検証をおこなうと共に、アデニル酸シクラーゼ阻害剤に対する効果減弱を確認する。また本学附属施設の化合物ライブラリを利用し、共通構造を有する化合物に対する平滑筋反応を測定し、同様に作用機序を検証する。さらにTrifolirhizinと同程度の分子量でかつkushenへの含有が認められるフィトケミカル類の[Ca2+]iに対する効果は、スクリーニング設備の再開次第、併用による相互作用も考慮しつつ検証する。
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Causes of Carryover |
超低温フリーザーの故障により、培養・測定に必要な実験器材・試薬を再購入の費用が生じる。また次年度は測定主義の変更に伴い、ハイスループットアッセイと異なり蛍光顕微鏡による画像処理が必要になる(気管支平滑筋培養細胞や気管上皮培養細胞を用いて[Ca2+]i変化をCa2+プローブと蛍光顕微鏡を用い画像解析する。)ため、情報処理端末とデータバックアップへの負荷が予想される。さらに、以下に対する各種試薬の購入に費用を用いる予定である。つまり、実際の収縮変化を検証するためのpMLC発現をWestern Blotによる確認、フィトケミカルの気管支収縮抑制に対する気管上皮からのPGs 分泌の証明のための、アデニルシクラーゼの抑制やEP2/4受容体の遮断やPKAの直接阻害による平滑筋収縮能変化の観察、可能であればwild typeラット摘出気管支を用いて気管上皮の有無やPGsの添加による影響をアセチルコリン刺激に対する収縮抑制効果を指標としたオーガンバス法による検討、などである。
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